Cathepsin b基因在斑马鱼早期胚胎发育中作用的研究

摘要

半胱氨酸组织蛋白酶cathepsin B主要存在于溶酶体中，是一种嗜酸性蛋白酶，能够水解胞内破损细胞器和蛋白质等，并且能够随小泡分泌到细胞外降解胞外基质中组分。斑马鱼中cathepsinb基因存在两种基因亚型，cathepsin ba(ctsba)和cathepsin bb(ctsbb)。
　　本论文利用CRISPR/Cas9技术敲除了斑马鱼cathepsin ba基因，并在子一代筛选获得cathepsin ba杂合突变体。通过ctsba杂合突变体互交获得子二代，部分胚胎在50％下包期胚胎发育出现停滞，其中一部分死亡，死亡数占全部胚胎的6.9％左右。另一部分胚胎在停滞约1-2h后恢复迟缓的发育，在咽囔期出现明显的形态畸形，包括心包囊肿、尾部折叠和弯曲等，发育至2-3天后死亡，这部分胚胎占全部胚胎数量的19.3％，经基因鉴定结果显示这些死亡胚胎均为纯合突变体。胚胎死亡率大概占全部胚胎数量的四分之一，符合孟德尔遗传定律，说明ctsba基因存在隐性致死效应。RT-PCR检测ctsba-/-突变体中发生非编码的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD），说明ctsba基因敲除成功。利用RT-PCR技术和原位杂交技术分析表明，cathepsin ba为母源性和合子表达的基因，集中表达于动物极，在斑马鱼胚胎中广泛表达，且在卵黄合胞体层与神经管中表达量较高。利用背、腹部标记基因chordin和gata2进行原位杂交，发现在ctsba杂合体和纯合突变体shield期chordin、gata2基因并未出现异常表达，但75％下包期chordin在ctsba-/-突变体背中线表达量减少。50％下包期是斑马鱼原肠胚期的开始，是三胚层分化形成的关键时期，利用内、中、外三胚层标记基因sox17、eve1、gsc在ctsba杂合突变体自交后代中进行原位杂交，根据原位杂交结果和基因型鉴定结果分析，在ctsba-/-胚胎中sox17、eve1、gsc均出现异常表达:sox17在75％下包期开始表达出现扩散现象，并且bud期内胚层前体细胞明显减少;eve1在咽囔期胚胎尾部出现表达异常;gsc表达量从75％下包期开始比野生型明显降低。实验结果提示ctsba基因可能参与了斑马鱼背部发育，在斑马鱼原肠胚时期可能参与了细胞运动和三胚层形成，ctsba基因缺陷可能因此而导致广泛的胚胎畸形和致死效应。
　　本论文还利用CRISPR/Cas9技术敲除了斑马鱼cathepsin bb基因，并筛选获得cathepsin bb突变体。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 Cathepsin ba基因在斑马鱼胚胎发育早期的作用

1．1 Cathespins家族介绍

1．2 Cathepsin B研究进展

1．3 斑马鱼应用于多种人类疾病研究

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 载体、菌株、工具酶和试剂盒

1．3 其他试剂

1．4 实验仪器

2 实验方法

2．1 利用CRISPR／Cas9技术获得斑马鱼cathepsin ba基因突变体

2．2 观察cathepsin ba基因突变体早期胚胎发育情况

2．3 RT-PCR与qPCR分析cathepsin ba在斑马鱼各发育时期中的表达

2．4 RT-PCR分析ctsba-／-突变体中mRNA表达情况

2．5 原位杂交分析cathepsin ba在斑马鱼早期胚胎表达

2．6 心脏标记基因原位杂交分析斑马鱼ctsba-／-变体心室发育

2．7 背腹轴标记基因原位杂交分析斑马鱼ctsba突变体背腹轴发育

2．8 利用三胚层标记基因原位杂交分析ctsba-／-突变体胚层发育

3 结果与讨论

3．1 利用CRISPR／Cas9技术筛选获得cathepsin ba突变体

3．2 cathepsin ba纯合突变体早期发育存在广泛畸形及隐性致死效应

3．3 RT-PCR结果显示ctsba-／-突变体中发生NMD现象

3．4 RT-PCR与qPCR分析cathepsin ba基因在斑马鱼中呈现母源性及合子表达

3．5 原位杂交分析cathepsin ba基因在斑马鱼早期胚胎中泛表达

3．6 心脏标记基因原位杂交显示斑马鱼ctsba-／-突变体心室发育无异常

3．7 背腹轴标记基因原位杂交表明斑马鱼ctsba-／-突变体背部发育异常

3．8 三胚层标记基因原位杂交显示ctsba-／-突变体各胚层发育异常

讨论

第二章 Cathepsbz bb基因在斑马鱼胚胎发育早期的作用

1．4 实验仪器

2 实验方法

2．1 利用CRISPR／Cas9技术获得斑马鱼cathepsin bb基因突变体

2．2 观察cathepsin bb基因突变体早期胚胎发育情况

2．3 RT-PCR分析cathepsin bb在斑马鱼各发育时期中的表达

2．4 RT-PCR分析cathepsin bb基因在斑马鱼各器官组织中的表达

3 结果与讨论

3．1 利用CRISPR／Cas9技术筛选获得cathepsin bb突变体

3．2 观察cathepsin bb基因突变体早期胚胎发育、成体正常

3．3 RT-PCR初步检测cathepsin bb基因早期各发育时期不表达

3．4 RT-PCR检测cathepsin bb基因在斑马鱼各组织器官中的表达情况

讨论

参考文献

致谢