Dishevelled作用蛋白Lurap1调节细胞极性和Wnt受体Frizzled8a调节视网膜细胞分化的机制研究

摘要

Wnt信号通路，无论是经典的Wnt/β-catenin信号还是非经典的Wnt/PCP信号，调控许多生物学过程，贯穿所有动物的早期胚胎发育和成体时期，并且对疾病的发生也具有重要的作用。在这两个信号途径中，Frizzled(Fz)受体和Dishevelled(Dvl)相互作用转导信号的传递，调控细胞增殖、细胞分化、细胞极性和干细胞自我更新等多种重要的细胞过程。在胚胎发育过程中，Fz和Dvl介导的Wnt信号途径对调节细胞的定向运动和细胞分化具有重要的作用，但这两个Wnt信号途径的关键成分在这些发育过程中的调控机制还有待进一步的研究。我们以斑马鱼原肠胚形成过程中的集中延伸运动和视网膜发育为例，分别研究了Dvl在Wnt/PCP途径中调节细胞极性和Fz8a在Wnt/β-catenin途径中影响视网膜细胞分化的作用机制。
　　Wnt/PCP信号通路是调节集中和延伸运动的关键信号通路。Wnt/PCP信号通路中包含PCP核心蛋白Fz受体和Dvl。Dvl是一个衔接体蛋白，作为该通路的保守核心成员，将Wnt/PCP信号从细胞膜受体传递到下游的效应分子，调节细胞骨架的极性组装。Dvl有三个保守的结构域-DIX、PDZ和DEP。DIX调节Dvl的聚合作用。PDZ直接与Fz以及其他细胞内蛋白相互作用。位于C端的DEP也含有与其他蛋白相互作用的位点。因此，这三个结构域分别与不同的因子结合，进而介导不同的效应信号。功能研究表明，PDZ和DEP结构域对于激活Wnt/PCP信号通路以及建立和维持原肠胚形成过程中的细胞极性是必需的。但是Dvl蛋白活性的调节机理到目前仍然不清楚。
　　我们发现了一个新的Dvl结合蛋白Lurap1(Leucine-repeat adaptor protein1)。该蛋白在各种脊椎动物中具有高度的保守性，通过其C末端的PDZ结合基序与Dvl的PDZ结构域直接结合，特异地参与调节Wnt/PCP通路的活性，而对Wnt/β-catenin通路没有影响。利用活体成像观察，我们发现在斑马鱼的lurap1母源合子突变体(MZlurap1)中，侧部细胞向背中线的集中以及背中线细胞沿前后轴方向的延伸发生紊乱，因此导致集中和延伸运动缺陷。进一步的研究显示，Lurap1调节未来脊索细胞形成丝状和片状伪足的能力和方向。更深入的机制研究发现，Lurap1很可能通过调节运动细胞中微管组织中心的定位，进而影响细胞极化和定向运动所需的细胞骨架重排。功能互作研究证明，Lurap1抑制Dvl在Wnt/PCP途径中对JNK的激活。这些结果表明Lurap1很可能通过阻止Dvl的细胞膜招募，进而在原肠胚形成过程的细胞极性和运动行为中负调节Wnt/PCP通路的活性，促使该通路的局部激活。
　　在脊椎动物早期发育过程中，眼睛的形成是一个高度协调的过程。从早期眼区的特化到各个眼组织的发育都需要多种转录因子和信号通路的调控。其中Wnt信号通路在眼发育的不同方面具有重要的作用。已有的研究表明Wnt/β-catenin信号通路在视网膜有丝分裂细胞中被激活，调节和维持视网膜前体细胞的增殖。虽然一些Fz受体蛋白也参与眼的发育，但它们调节眼发育的机制还不清楚。fz8a基因在斑马鱼发育早期表达在眼区，随后表达在视网膜。利用TALENs基因编辑技术敲除fz8a后，我们发现fz8a的纯合突变体中产生了小眼表型。在组织、细胞和分子水平上的分析显示，视网膜前体细胞不能正常的退出细胞周期而进入有丝分裂后的分化状态。因此导致了视网膜细胞分化的延迟并伴随着细胞凋亡的增加，最后引起视网膜细胞核层分层的异常，视网膜细胞的逐渐减少和小眼表型。这些结果暗示了在视网膜前体细胞分化过程中Fz8a在调控细胞周期的进程中具有特异的功能。
　　Wnt信号通路在所有动物的整个生命过程中起着至关重要的作用。Wnt信号通路的异常引起众多的人类疾病。Dvl作为一个分支点，接收来自Fz受体的信号，转导不同的Wnt信号通路。进一步鉴定和分析新的Dvl作用蛋白的功能有助于我们深入了解调节不同Wnt信号通路活性的机制。众多的Wnt受体Fz既具有信号转导也具有组织表达的特异性。确定Fz受体的组织特异性功能有助于我们深入认识Wnt通路调节的发育过程。Fz8a缺失所导致的视网膜细胞分化异常对人类眼科疾病的认识具有明显的理论意义和潜在的应用前景。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 Wnt信号通路调节细胞极性和细胞增殖分化

1．1．Wnt信号通路

1．1．1．经典Wnt信号通路

1．1．2 非经典wnt信号通路

1．1．3．Wnt／Ca2+信号通路

1．2．非经典Wnt信号通路调节细胞极性

1．2．1．原肠作用中的细胞运动

1．2．2．集中延伸运动中的细胞行为

1．2．3．细胞极性

1．3．经典Wnt信号通路调节视网膜细胞的增殖和分化

1．3．1．脊椎动物眼的形态发生

1．3．2．眼区的形成和分裂

1．3．3．视网膜的增殖和分化

1．3．4．斑马鱼眼的形态发生调控

1．4．结论和展望

参考文献

第二部分 Dishevelled作用蛋白Lurapl调节细胞极性

2．1．引言

2．2．结果

2．2．2．MZlurap1中近轴侧部细胞和脊索细胞运动紊乱

2．2．3．Lurapl拯救了MZlurap1胚胎中的细胞运动缺陷

2．2．4．Lurap1与Dvl和JNK相互作用调节细胞极性

2．2．5．Lurap1的亚细胞定位

2．2．6．MZlurap1中MTOC的定位紊乱

2．2．7．Lurap1通过Dvl抑制JNK信号活性

2．3．结论与讨论

参考文献

第三部分 Wnt受体Frizzled8a调节视网膜的细胞分化

3．1．引言

3．2．结果

3．2．1．Wnt受体Fzd8a突变体构建

3．2．2．fzd8a母源合子突变体眼的尺寸减小

3．2．3．fzd8a母源合子突变体眼发育缺陷

3．2．4．fgd8a母源合子突变体背腹轴图式正常

3．2．5．fzd8a母源合子突变体眼区的特化正常

3．2．6．fzd8a母源合子突变体视网膜分层延迟

3．2．7．fzd8a母源合子突变体视网膜分层紊乱

3．2．8．fzd8a母源合子突变体视网膜分化延迟

3．2．9．fzdSa母源合子突变体视网膜细胞增殖异常

3．2．10．fzdSa母源合子突变体视网膜细胞周期退出延迟

3．3．结论与讨论

参考文献

4．1．实验动物

4．2．显微注射

4．3．TALENs基因编辑技术制备突变体

4．3．1．TALENs靶点选择的原则

4．3．2．TALENs靶点的构建

4．4．分子实验

4．4．1．总RNA提取

4．4．2．cDNA合成

4．4．3．探针质粒构建

4．4．4．体外转录和纯化

4．5．斑马鱼胚胎整封原位杂交

4．6．HE染色

4．6．1．主要试剂及配制方法

4．6．2．实验材料

4．6．3．石蜡包埋

4．6．4．石蜡切片

4．6．5．HE染色的基本步骤

4．7．BrdU检测

4．7．1．试剂配制

4．7．2．BrdU孵育

4．7．3．样品准备

4．7．4．BrdU免疫荧光

4．8．pH3检测

4．8．1．试剂和样品准备

4．8．2．pH3免疫荧光

4．9．凋亡检测

4．9．1．样品准备

4．9．2．TUNEL染色

4．10．视网膜实验统计方法

4．10．1．视网膜细胞数量统计

4．10．2．视网膜细胞核层宽度统计

4．10．3．BrdU阳性细胞统计

4．11．斑马鱼整封免疫荧光

4．12．细胞运动轨迹追踪

4．12．1．样品材料准备

4．12．2．Time-lapse拍摄

4．13．细胞行为检测

4．13．1．细胞移植

4．13．2．Time—lapse拍摄和视频导出

4．13．3．细胞突出角度统计方法

4．13．4．脊索细胞极性统计方法

4．14．MTOC定位检测

4．14．1．MTOC运动轨迹

4．14．2．MTOC定位统计

4．15．ATF2报告基因检测

4．15．1．实验原理

4．15．2．实验步骤

参考文献

攻读学位期间完成的工作

致谢