TLR2与IFN--γ在吞噬细胞抵抗李斯特菌感染中的作用研究

摘要

目的: 李斯特单增菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一种革兰氏染色阳性的胞内菌，主要通过胃肠道感染，能够入侵吞噬细胞和非吞噬细胞(例如肝细胞)。入侵机体后，Lm在肝脾中寄生和复制，然后通过血液进入大脑或胎盘引起脑膜炎、脑炎、败血症，导致患者死亡，死亡率为20-30％。 Lm上有多种成分可以被Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)识别，不同的TLR在Lm的识别中发挥不同的作用:Lm在宿主体内不表达鞭毛成分，因此无法被TLR5识别;而TLR4和TLR9缺失并不影响机体对Lm的免疫应答。TLR2在抗Lm中发挥重要作用，包括增强巨噬细胞的吞噬能力，促进TNF-α、IL-12及NO产生，促进共刺激分子CD40和CD86的表达。 作为天然免疫系统的重要成员，巨噬细胞在抵抗Lm感染中发挥关键作用。在感染早期巨噬细胞吞噬Lm，限制细菌的复制和扩散。作为巨噬细胞功能的主要调节因子，γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)在宿主抵抗Lm感染中十分重要。IFN-γ可通过上调杀菌分子如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，促进巨噬细胞介导的细菌清除。此外，IFN-γ可诱导MHC-Ⅱ的表达，从而增强抗原呈递并引发适应性免疫反应。活化的NK细胞或T细胞被认为是IFN-γ的主要来源。 在肝脏中，组织驻留的巨噬细胞—Kupffer细胞(KC)在细菌毒力因子LLO的刺激下被迅速诱导细胞死亡。循环中的单核细胞在肝脏中分化成巨噬细胞并补偿KC损失。除巨噬细胞外，吞噬细胞的另一个重要成员中性粒细胞在Lm感染的早期发挥作用。中性粒细胞是血液中比例最高的白细胞，其在感染后最先到达感染部位并吞噬病原体。然而，中性粒细胞在抗Lm感染免疫应答中的作用研究较少，并且报道的结论相互间矛盾。 吞噬细胞在急性Lm感染过程中发挥重要作用，包括吞噬限制细菌扩散、分泌细胞因子和趋化因子等。TLR2在吞噬细胞识别Lm中发挥重要作用，而IFN-γ促进吞噬细胞的活化和杀菌功能。但是，TLR2与IFN-γ是否具有其他功能，吞噬细胞之间存在怎样的相互作用，目前研究尚不明确。在本研究中，研究了肝脏中TLR2在单核/巨噬细胞向肝脏迁移过程中的作用和机制。阐明了IFN-γ参与了中性粒细胞和巨噬细胞的相互作用以及在Lm感染中发挥组织保护的作用与内在机制。 方法: 1.通过腹腔注射方式，建立Lm感染小鼠模型。通过对WT、Tlr2-/-、Tlr4-/-、Tlr9-/-及Ifng-/-小鼠的生存期、小鼠体重、肝脏和脾脏重量、细菌载量以及病理损伤(HE染色)的检测，判断小鼠对Lm感染的敏感性。 2.流式细胞术(FACS)检测WT与Tlr2-/-小鼠感染Lm前后，肝脏和脾脏中单核/巨噬细胞的比例和Ki-67水平，以及经CFSE标记后的单核/巨噬细胞体内向肝脏迁移水平。 3.肝脏原位灌流获取小鼠原代肝实质细胞，通过免疫荧光及FACS鉴定肝实质细胞纯度。建立肝实质细胞体外Lm感染模型，并通过FACS检测感染后肝细胞凋亡水平。 4.蛋白芯片技术、qPCR及ELISA检测WT与Tlr2-/-小鼠肝细胞分泌细胞因子和趋化因子的水平;qPCR检测单核/巨噬细胞上趋化受体表达水平。 5.通过Transwell技术联合使用趋化因子、受体阻断剂或TLR激动剂检测肝细胞上TLR2对单核/巨噬细胞的招募能力的影响。 6.通过Transwell技术联合使用NO供体与清除剂，并通过罗丹明-鬼笔环肽染色检测F-actin聚合，研究TLR2/NO/F-actin通路对巨噬细胞的自身运动能力的影响。 结果: 1.TLR2保护小鼠抵抗Lm感染 WT和Tlr2-/-、Tlr4-/-、Tlr9-/-小鼠经腹腔注射1×106CFU Lm，与其他小鼠相比Tlr2-/-小鼠生存期明显缩短。感染2天时，Tlr2-/-小鼠脾脏不肿大，血清中IFN-γ和IL-6的分泌水平较低，提示脾脏免疫应答功能可能存在障碍。感染3天时，Tlr2-/-小鼠肝脏和脾脏中呈现更高的载菌量。这些现象说明，TLR2的缺失使得小鼠对Lm感染更加敏感，TLR2在小鼠抵抗Lm感染中发挥重要的保护作用。 2.TLR2促进肝脏单核/巨噬细胞浸润 Lm感染2天时，Tlr2-/-小鼠肝脏中单核/巨噬细胞的比例和绝对数远远低于WT感染小鼠，而两者的增殖水平没有差异。向WT或Tlr2-/-小鼠转输中CFSE标记的WT与Tlr2-/-小鼠的腹腔渗出细胞(PEC)，与Tlr2-/-小鼠相比，WT受体小鼠的肝脏能募集更多的单核/巨噬细胞。建立肝实质细胞体外感染Lm模型并排除了Lm对WT和Tlr2-/-小鼠的肝实质细胞感染差异和凋亡影响后，使用Transwell检测了肝实质细胞对单核/巨噬细胞迁移的影响，WT肝细胞招募单核/巨噬细胞能力更强，并且WT单核/巨噬细胞表现出更强的迁移能力。说明TLR2促进单核/巨噬细胞向肝脏浸润。 3.TLR2促进肝细胞分泌CCL2和CXCL1招募单核/巨噬细胞 与WT小鼠相比，Tlr2-/-小鼠体内感染Lm后的肝组织匀浆以及肝细胞体外感染Lm的培养上清中CCL2和CXCL1的产生减少。外源加入CXCL1可促进单核/巨噬细胞的迁移，而CXCL1受体CXCR2阻断后能够明显抑制WT肝细胞介导的单核/巨噬细胞浸润。与WT小鼠相比，Tlr2-/-小鼠的单核/巨噬细胞中Cxcr2的表达较低。说明Lm感染后TLR2活化促进肝细胞产生CCL2和CXCL1;除了CCL2之外，CXCL1-CXCR2信号是TLR2诱导单核/巨噬细胞向肝脏趋化的另一个重要途径。 4.TLR2通过NO途径调节F-actin聚合促进单核/巨噬细胞的迁移运动 在Transwell室迁移试验中，体内感染Lm的WT来源的单核/巨噬细胞有明显的迁移运动能力，而Tlr2-/-来源的单核/巨噬细胞迁移能力受损，并且体内或体外感染的Tlr2-/-来源的单核/巨噬细胞的F-actin聚合水平低于WT来源的单核/巨噬细胞。Lm和TLR2激动剂Pam3CSK4都能够刺激WT来源的单核/巨噬细胞产生NO。NO的供体(SNP)能够促进单核/巨噬细胞的迁移和F-actin聚合，NO清除剂可抑制TLR2诱导的单核/巨噬细胞的迁移和F-actin聚合。说明TLR2通过TLR2/NO/F-actin途径影响巨噬细胞迁移。 5.TLR2促进肝脏小脓肿形成 Lm感染2天时，与WT小鼠相比，Tlr2-/-小鼠的肝脏小脓肿体积小、数量少。未感染Lm时，WT和Tlr2-/-小鼠的单核/巨噬细胞均匀散布在肝脏中。Lm感染后，WT小鼠中单核/巨噬细胞聚集形成肝脏小脓肿;而Tlr2-/-小鼠大多数单核/巨噬细胞依然散在分布，很少参与到小脓肿中。在WT小鼠中Lm被限制在肝脏小脓肿中;而在Tlr2-/-小鼠中，Lm在整个肝脏中扩散和复制。说明TLR2通过促进单核/巨噬细胞迁移，参与肝脏小脓肿的形成，进而限制Lm扩散。 6.TLR2促进巨噬细胞对Lm的识别、吞噬和杀伤 TLR2存在与否不影响巨噬细胞对颗粒的吞噬能力，但是TLR2缺失会降低巨噬细胞对Lm的吞噬。感染后Tlr2-/-小鼠肝脏巨噬细胞上吞噬相关受体CD169、CD204和CD206表达低于WT小鼠。清除巨噬细胞的Tlr2-/-小鼠转输WT来源的巨噬细胞后进行Lm感染，其肝脏巨噬细胞上CD169、CD204和CD206的表达也有所恢复，生存期得以延长。Tlr2-/-巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达远低于WT巨噬细胞，并且Tlr2-/-巨噬细胞的细菌载量高于WT巨噬细胞。说明TLR2促进巨噬细胞对Lm的识别、吞噬和杀伤，在巨噬细胞介导的抗Lm应答中发挥关键作用。 结论: 1.TLR2在小鼠抵抗Lm感染中发挥重要的保护作用。Lm感染过程中，TLR2促进肝细胞分泌CCL2和CXCL1，促进单核/巨噬细胞向肝脏浸润。其中，CXCL1-CXCR2信号是TLR2依赖的影响单核/巨噬细胞向肝脏趋化的一个重要的途径。TLR2通过TLR2/NO/F-actin途径促进巨噬细胞的迁移能力，促进单核/巨噬细胞参与肝脏小脓肿的形成，进而限制Lm扩散。另外，TLR2促进巨噬细胞对Lm的识别、吞噬和杀伤，在巨噬细胞介导的抗Lm应答中发挥关键作用。 2.中性粒细胞是Lm急性感染过程中IFN-γ的重要来源。Lm感染后IFN-γ迅速产生，并且通过增强杀菌作用和抑制Lm诱导的组织损伤，在抗Lm感染的免疫应答中起关键作用。IFN-γ可以促进NO的产生而增强中性粒细胞的抗Lm活性，并通过控制Lm载量而减少中性粒细胞的凋亡、促进中性粒细胞的存活，同时阻止中性粒细胞的凋亡而导致的ROS释放，可以有效缓解Lm感染引发的组织损伤。另外，IFN-γ可促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞，并同时获取MPO和分泌TGF-β，从而有助于缓解组织损伤。

目录

声明

摘要

缩略语说明

第一部分：吞噬细胞在抵抗李斯特单增菌中的作用(文献综述)

1 李斯特单增菌

1．1 Lm的基本生物学特征

1．2 Lm感染过程

1．3 毒力因子

2 吞噬细胞

2．1 中性粒细胞

2．2 单核／巨噬细胞

2．3 树突状细胞

3 吞噬细胞在抵抗Lm中的作用

3．1 识别Lm

3．2 吞噬Lm

3．3 杀菌功能

3．4 分泌细胞因子

3．5 招募与趋化

3．6 抗原递呈功能

3．7 组织损伤与保护

4 小结

参考文献

第二部分：TLR2在促进巨噬细胞迁移进入肝脏和抵抗李斯特单增菌感染中的作用和机制研究

1 前言

2 材料和方法

2．1 主要材料及试剂

2．2 主要试剂配制

2．3 主要仪器设备

2．4 主要实验方法

3 结果

3．1 Lm感染小鼠模型的建立

3．2 TLR2保护小鼠抵抗Lm感染

3．3 TLR2促进肝脏单核，巨噬细胞浸润

3．4 TLR2促进肝细胞分泌趋化因子招募单核／巨噬细胞

3．5 TLR2促进单核／巨噬细胞迁移运动

3．6 TLR2通过NO途径调节F-actin聚合

3．7 TLR2促进肝脏小脓肿形成

3．8 TLR2在巨噬细胞介导的抗Lm应答中起关键作用

4 讨论

参考文献

第三部分：IFN-γ对中性粒细胞抗李斯特单增菌感染功能和诱导组织损伤中的作用与机制研究

1 前言

2 材料和方法

2．1 主要材料及试剂

2．2 主要实验方法

3 结果

3．1 Lm感染后IFN-γ迅速产生并发挥重要的保护作用

3．2 中性粒细胞是Lm急性感染过程中IFN-γ的重要来源

3．3 IFN-γ增强中性粒细胞的抗Lm活性

3．4 IFN-γ促进中性粒细胞存活

3．5 Lm诱导中性粒细胞凋亡通过释放ROS造成组织损伤

3．6 IFN-γ促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞

3．7 巨噬细胞吞噬凋亡中性粒细胞可缓解组织损伤

4 讨论

参考文献

论文创新点及意义

致谢

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