麻风风险预测模型的构建与效能评价

摘要

本研究拟在前期研究的基础上，基于已经定位的32个麻风风险位点研发高危个体易感基因筛查芯片，利用筛查芯片对已经分型明确的麻风患者与正常对照大约各2000例进行分型，分型结果与GWAS数据库进行比对，确定筛查芯片的敏感度、特异度，以易感基因风险位点为风险因素通过数学分析构建麻风发病风险预测模型，为了评价模型的效力，随后对既往山东地区麻风高发县的麻风密切接触者进行筛查，研究麻风密切接触者中麻风菌的感染情况，最后对2210例康复者和9972例密切接触者进行基因分型，对预测模型的效能进行交叉验证，以期为麻风高危人群筛查、亚临床感染患者的确定提供诊断依据、为实现麻风的“精准”化学预防、消除麻风危害奠定基础。 本研究分二阶段进行: 第一阶段:基于麻风风险因子构建筛查芯片并建立风险预测模型 第二阶段:麻风密切接触者筛查及风险预测模型效能评价 第一阶段:基于麻风风险因子构建筛查芯片并建立风险预测模型 研究目的： 基于课题组前期通过麻风全基因组关联研究发现的30个麻风发病风险位点，联合临床相关信息，建立中国人群麻风风险预测模型。 研究方法： 1.研发麻风高危人群易感基因筛查芯片 本研究采用QuantStudioTM12K Flex OpenArray(@)芯片技术定制包含30个SNPs的麻风高危个体易感基因筛查芯片。30个SNPs来自课题组既往发表的GWAS文章中达到全基因组关联水平并且最小等位基因频率(Minor Allele Frequency，MAF)大于0.01的位点。芯片的制作工作由美国Thermo Fisher Scientific公司完成。 2.利用易感基因筛查芯片对研究样本进行基因分型 本研究分为两部分样本，第一部分样本基因分型数据来自既往发表的GWAS文章。第二部分新增加样本包括1，692名麻风病患者和1，330名正常对照，采用高危个体易感基因筛查芯片(QuantStudioTM12K Flex OpenArray(@)芯片)进行基因分型。 3.SNPs及样本的质量控制(quality control，QC) 本研究SNPs的过滤标准如下:1、去掉5个得出率(call rate)＜95％的SNPs(rs145562243、rs58600253、rs73058713、rs4720118、rs55882956);2、去掉在发现队列的对照中Hardy-Weinberg Equilibrium(HWE)P值＜10-3的SNPs(没有SNP符合)。最终30个SNPs中有25个通过质量控制。 样本在25个SNPs基因分型数据中有缺失值的不纳入下一步分析。经此步过滤后样本队列剩余2，144名麻风患者和2，671名正常对照。 4.麻风易感基因筛查芯片的效能检测 本研究利用PLINK v1.07软件基于logistic回归模型对表型和25个SNPs之间的关系进行计算。结果表明，这25个SNPs的P值均＜0.05(表1)，且OR值与既往文章报道的结果一致。该结果证明该麻风易感基因筛查芯片具有较好的检测效能。 5.麻风风险模型的构建 研究采用加权法计算SNP位点风险评分。在对风险等位基因进行合并时，考虑每个SNP本身对疾病发生的单独效应，假设每个位点对麻风易感性的影响不同，但与其OR值有关，此时GRS为每个SNPβ值(ln(OR))加权后的平均风险等位基因个数。其中β值来自利用25个SNPs做logistic回归模型时的系数。基于麻风风险位点分别构建了4种风险模型。模型1:基于GRS方法利用25个SNPs构建;模型2:基于GRS方法利用表1中P值＜5E-8的7个SNPs构建;模型3:基于贝叶斯网络方法利用25个SNPs构建;模型4:基于贝叶斯网络方法利用表1中P值＜5E-8的7个SNPs构建。 研究结果： 1.风险预测模型的建立 在所有模型中，Hosmer-Lemeshow检验的P值均＞0.05(从模型1到4，P值分别为0.060，0.093，0.627，0.712)，说明四种风险模型都具有一定的拟合效果;利用受试者特征(ROC)曲线及计算曲线下面积(AUC)评价模型的预测效果，基于wGRS建立的风险预测模型最佳，其曲线下面积(AUC)为0.743。 2.无论基于GRS方法还是贝叶斯网络方法，25个SNPs建模要优于7个SNPs，利用25个SNPs建模时基于GRS方法(AUC=0.743)要优于贝叶斯网络(AUC=0.731)(P值=5.81E-4)。 3.基于SNPs得出的GRS在麻风患者和正常对照中的分布图显示，病例组峰值明显偏右，也说明该模型有良好的区分能力。 4.根据GRS风险评估，确定风险阈值并分组。最高风险组GRS大于28.06是最低风险组(GRS＜=18.17)发病风险的24.65倍。 研究结论： 1.成功构建麻风的发病风险预测模型，可以评估高风险人群，为“精准”化学预防奠定理论基础。 2.我们的研究将为卫生部麻风防治策略的制定提供重要指导建议。 第二阶段:麻风密切接触者筛查及风险预测模型的效能评价 研究目的： 1.早发现、早诊断麻风康复者及密切接触者中的潜伏感染者。 2.应用风险预测模型筛查麻风康复者及其密切接触者中的高危个体。 3.评价麻风密切接触者的感染情况，结合风险预测结果，评估和随访高危个体。 研究方法： 1.随访人群:根据全国麻风防治系统登记，选取既往麻风高发区20个县市，大约占历史上麻风感染者总人数的80％。随访登记在全国麻风防治系统中现存的麻风感染人群2210例及其家庭内密切接触者和邻居。麻风密切接触者的定义:不管是否与麻风患者长期生存在一个屋檐下，包括麻风患者的一级，二级和三级直系亲属。邻居是居住在距离麻风感染者家庭的200米以内的邻居，无血缘关系。所有被随访人均签署知情同意书(儿童经监护人签署知情同意)。 2.随访专家组由4名麻风防治人员，2名医学研究生进行家庭随访。 3.随访项目:家庭内密切接触者填写调查问卷主要是年龄，性别，民族，家庭收入，受教育程度，居住情况，病史，结核疫苗接种史，皮肤情况，过敏史以及麻风的接触史等。每个患者都会常规进行皮肤测试，眼科，浅表神经的检查等。 4.麻风的诊断参照国家GB15973-1995诊断标准，至少满足下列标准的两条或者以上(1)皮肤科症状(2)浅表神经受累(3)组织液查菌阳性(4)组织学病理发现泡沫细胞或者上皮样细胞肉芽肿，S-100染色看到破碎的神经，查菌阳性。所有采集的麻风病例既往无结核和其他感染性疾病病史，无银屑病、疱病等自身免疫性疾病病史。临床亚型分型标准根据Ridley和Jopling标准完成。 5.统计分析:数据统一录入Microsoft Excel XP，应用STATISTICA(release6.1，StatSoft，USA)分析软件。 6.应用第一阶段构建的易感基因筛查芯片对麻风康复者及密切接触者进行基因分型，确定风险因子的携带情况，最后导入最优化风险预测模型，筛选高危人群。 7.麻风的酚糖酯抗原检测等方法评价接触者人群的麻风菌感染情况。 研究结果： 1.随访观察2210麻风康复者，筛查家庭内密切接触者7877和邻居1865例，可疑患者35例，经过临床和病理及其实验室检查最后诊断11例可疑自愈少菌型患者，2例多菌型麻风患者，1例复发患者。随访项目县的麻风患者检出率为0.12％。随访的人群中家庭内密切接触者和邻居之间麻风的检出率没有统计学差异，同样观察到麻风患者的家族聚集倾向。 2.麻风密切接触者的酚糖酯抗原阳性率和PCR检测的麻风菌鼻携带率分别是4.67％和0.3％;但PGL抗体阳性率在家庭内密切接触者和邻居之间却无显著性差异。 3.风险模型在麻风康复者及密切接触者人群中进行了验证，GRS在康复者和正常对照中的分布图显示，病例组峰值明显偏右，也说明该模型有良好的区分能力AUC=0.707。 4.根据GRS风险评估，麻风密切接触者中最高风险组GRS大于28.06是最低风险组(GRS＜=18.17)发病风险的10.68倍。 5.监测随访29例密切接触者可以检出1例麻风患者，大大缩小了监测人群的范围，也为“精准”化学预防奠定了理论基础。 研究结论： 1.麻风密切接触者筛查是早发现、早诊断的必要手段，在降低畸残率方面起着至关重要的作用。 2.麻风风险预测模型在康复者及密切接触者人群中得到了很好的验证，该研究有助于未来“精准”化学预防的实施。

目录

声明

摘要

常用符号说明及缩略词表

1．1研究背景

1．1．1全球麻风的流行现状

1．1．2我国麻风的流行现状

1．1．3麻风的传播与疫苗尝试

1．1．4麻风的防治研究现状

1．1．5麻风的遗传学研究现状

1．2立题依据

1．2．1遗传学研究成果向临床的转化思路

1．2．2风险模型国内外研究现状

第二章基于麻风风险因子构建筛查芯片并建立风险预测模型

2．1实验材料和方法

2．1．1研究对象和位点选取

2．1．2研发麻风高危人群易感基因筛查芯片

2．1．3利用易露基因筛查芯片对研究样本进行基因分型

2．1．4 SNPs及样本的质量控制(quality control，QC)

2．1．5麻风易感基因筛查芯片的效能检测

2．1．6 GRS计算及logistic回归分析

2．2实验结果

2．2．1风险预测模型纳入变量的考察

2．2．2 SNPs位点风险评分(Genetic risk score，GRS)

2．2．3贝叶斯网络(Bayesian network)

2．2．4风险预测模型的构建

2．2．5风险预测模型的评价

2．3实验讨论

2．4实验结论

第三章麻风密切接触者筛查及风险预测模型的效能评价

3．1康复者及密切接触者筛查

3．1．1研究对象和随访项目

3．1．2实验准备材料及耗材

3．1．4随访人群统计分析

3．1．5典型病例展示

3．1．5结果讨论

3．2风险预测模型的效能评价

3．2．1研究对象

3．2．2基因分型及质控

3．2．3 GRS计算和logistic回归分析

3．2．4模型验证结果

3．2．5风险模型效能评价的讨论

3．3麻风密切接触者酚糖酯抗原的检测

3．3．1主要试剂及配制

3．3．2 ELISA实验步骤

3．3．3鼻粘膜拭子DNA提取及RT-PCR反应

3．3．4实验结果

3．3．5结果讨论

参考文献

全文总结与展望

致谢

在读期间论文发表情况

外文论文一

外文论文二

外文论文三

学位论文评阅及答辩情况表