NBS1基因多态性与慢性乙肝病毒感染引起的肝细胞癌的相关性及生物学功能研究

摘要

目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)居中国恶性肿瘤死亡率的第三位，并且呈逐年上升趋势。大部分的肝癌患者在晚期才被确诊出，因此其5年生存率小于10％。目前肝癌的治疗手段主要以手术为主，化疗、放疗为辅，总体预后不良，因此需要寻找一种更加有效的辅助治疗方法，从而提高肝癌的治疗效果。在中国约80％的肝癌患者有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染史，这在很大程度上反映了慢性HBV感染与HCC患病的关系。由病毒性肝炎和肝硬化最终发展为肝癌是肝癌形成的重要过程，然而只有一部分慢性HBV携带者发生肝癌，表明宿主遗传因素也可能参与HCC的发病过程。 DNA损伤后，细胞周期检查点的缺失可以作为肝癌发生的标志。有研究结果显示DNA双链断裂可使HBV的整合率明显提高，从而促进HCC的发生发展。NBS1基因作为一种重要的DNA双链修复相关基因，对维持基因组稳定性及防止细胞癌变具有非常关键的作用，在维持端粒稳定、开启免疫球蛋白及减数分裂重组、促进胚胎发育等发面也发挥了重要作用。流行病学资料显示，NBS1缺失的杂合子可能不会出现相关临床症状，但患者发生恶性肿瘤的风险仍有明显增高，尤其是乳腺癌、前列腺癌、直肠癌、白血病及非霍奇金淋巴瘤等，但尚无研究明确证明其与肝癌发生有相关性。NBS1基因突变可促进小鼠肝癌的发生，多个NBS1单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）位点可以增加患某些癌症的风险。 NBS1SNP在HBV相关HCC中无大宗病例报道，基因调控机制的研究也较少。本文在之前报导的基础上，首先做了NBS1基因多态性与慢性HBV感染引起的HCC的相关性分析，然后运用Meta分析的方法作系统综述，进一步明确阳性位点rs1805794C/G多态性与各种癌症易感性的关系，最后，探究基因调控对肝癌细胞功能的影响机制。 方法:从本院（山东省医学科学院附属医院）就诊的患者及体检的健康人群中随机选取508例HBV感染相关的HCC患者作为试验组;另外选取481例性别与年龄相匹配的HBV感染患者以及581例未被HBV感染的健康人作为对照组。根据相关选点原则，从先前的全基因组相关研究(GWAS)和NBS1候选基因关联研究中选取若干个SNP位点。收集全血标本提取基因组DNA，并用Taqman法进行基因分型。采用双侧卡方检验评估患者和对照组在年龄、性别、吸烟和饮酒状况分布上的差异，P＜0.05为统计学显著值。利用Plink软件、Cochran-Armitage趋势测试分析每组的基因型-表型关联。对多个SNP位点测试进行Bonferroni校正，P＜0.0125被认为有显著关联性。 为了进一步明确rs1805794C/G多态位点与癌症易感性的关系，运用Meta分析的方法对相关研究作出了系统的综述。研究中检索了2008年至2018年间在Pubmed及Embase公开发表的关于NBS1rs1805794与癌症易感性相关的临床研究，对纳入文献进行质量评价。用优势比(OR)和相对应的95％可信区间(95％CI)来评价NBS1rs1805794C/G多态性与癌症的关联性强度。按照种族、对照组来源及癌症种类进行亚组分类，以评价这些因素对关联分析的影响。最后，评估敏感性和发表偏倚。 采用不同浓度NBS1-siRNA对HepG2细胞作用不同时间，检测NBS1基因表达水平的变化，并利用CCK-8实验和流式细胞术分析转染前、后细胞的增殖和凋亡水平。最后，利用PI单染色法结合流式细胞分析技术检测细胞周期情况。 用中浓度的siRNA转染HepG2细胞抑制NBS1表达，24h或48h后提取细胞内总的mRNA，利用FluiDigm高通量基因分析仪对48个特定基因分别进行定量检测，其中B-actin和GAPDH为内参基因，根据|Fold Change|＞2.0，P＜0.05的标准筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。对上述两个时间点共有的差异表达基因进行基因本体论(Gene ontology，GO)分析(P＜0.05)，主要针对GO BP进行分析。认为P值越小，该条GO Term越有意义，选取排在前10位的GO Term进行分析;对两个时间点共有的差异表达基因通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)进行信号通路富集，根据P＜0.05的标准选取信号通路。 结果:选取了五个可能导致肝癌的NBS1SNPs，分别是rs10464867、rs1063053、rs1061302、rs1805794、rs709816。对参与者的全血DNA样本进行分析，其中四个位点(rs10464867、rs1063053，rs1805794、rs709816)被成功分型。发现这四个位点与HCC或慢性乙型肝炎的发病以及HBV的感染均无显著相关性。值得注意的是，发现NBS1rs1805794C/G在HBV感染患者进展成为HCC者中有重要作用(P=2.99E-03，OR=1.31)。 经过一系列的筛选，最终有21篇文献（包含25个独立研究）被纳入我们的Meta分析，包括10901例癌症病例及14124例对照。纳入研究的对照组基因分型均符合H-W平衡，文献质量评分为6.5-8.5分。 总体而言，携带C等位基因将增加患癌的风险(C vs.G:OR=1.21，95％CI:1.08-1.36，P=0.001)。亚组分析显示携带C等位基因将增加患肝癌(OR=1.37，95％CI:1.13～1.67,P=0.001)、白血病(OR=1.77,95％CI:1.19～2.63,P=0.005)及鼻咽癌(OR=1.98，95％CI:1.76～2.24，P＜0.001)的风险。鼻咽癌的所有遗传模型以及肝癌及白血病的大部分遗传模型下，NBS1rs1805794C/G多态性与增加患癌风险存在显著关联性。亚洲人群rs1805794C/G多态性与癌症风险的增加存在显著关联性，而在高加索人群的分析结果表明各基因型均无明显统计学意义;对照组为人群基础(population-based，PB)来源的研究中rs1805794C/G与癌症风险增加存在显著关联性，而医院基础(hospital-based，HB)来源的研究中各基因型均无明显统计学意义。 所有遗传模型的总体比较均发现显著异质性(P＜0.001)，故采用随机效应模型。亚组分层分析后，乳腺癌、结直肠癌、肝癌、淋巴瘤、鼻咽癌、高加索人群，PB来源的研究中异质性明显降低，在大部分的基因模型中P＞0.1。在逐步排除每一项研究时并没有观察到OR值出现统计学上的差异性变化，结果验证了本Meta分析结果的稳定性;Begg's漏斗图显示纳入的研究在各遗传模型的图形中分布基本对称，呈倒置漏斗形，表明没有发现明显的发表偏倚。 转染不同浓度NBS1-siRNA的HepG2细胞与对照组相比，转染后细胞活力明显减弱（P＜0.05或P＜0.01）。在转染24小时后，细胞增殖率较未转染的细胞即有所降低，但无明显差异(P＞0.05);随着转染时间增加，细胞增殖率急剧下降，当转染时间在48小时的时候增殖率下降最为显著;在转染72小时后，细胞增殖能力仍比未转染细胞有显著降低，但相比48小时后的转染率相差不大。综合来看，当用50nM siRNA转染细胞时细胞的增值率最低，且在48小时后效果最为显著。进一步采用流式细胞分析法观察siRNA转染48小时后细胞凋亡情况。与未转染细胞相比，细胞凋亡的比率在转染后明显升高(P＜0.05或P＜0.01)，并随浓度增加而更为显著。用中、高浓度的siRNA干扰NBS1表达后，HepG2细胞在S期的比例增加(P＜0.05)。结合上述siRNA可以抑制细胞增殖的实验结果，推测干扰NBS1的表达可以通过使细胞在S期发生阻滞而抑制细胞继续增殖。 与对照组比较，转染24小时后共有14个基因表达量上调，7个基因表达下调;而在转染48小时后，共有15个基因表达上调，5个基因表达下调。通过聚类图显示2个时间点的差异基因存在不同，韦恩图结果显示两个时间点共有的差异表达基因为11个，其中8个基因表达上调，包括IRS1、MET、CCND1、IFG2、PTK2、YAP1、MYC、PTEN;3个基因表达下调，分别为CDH13、TGFB1、AKT1。这些基因可能作为NBS1作用的下游靶点，调控肝细胞癌的进展。GO分析可知干扰NBS1后的差异表达基因除了影响基本的细胞生命活动功能，主要还可以调控细胞周期及细胞迁移等;而KEGG结果显示差异基因主要参与调控的信号通路包括癌症通路、前列腺癌及结直肠癌等信号通路。 结论:1.NBS1基因的rs1805794C/G多态性在HBV感染者中增加了患肝细胞癌的风险，很可能是中国汉族人群慢性HBV感染者患肝细胞癌的遗传易感性因素。 2.通过Meta分析，知道rs1805794C/G多态性可能对增加癌症的易感性有至关重要的影响，尤其在肝癌、白血病及鼻咽癌病种及亚洲人群中。 3.干扰NBS1在HepG2细胞中的表达可以使细胞周期停滞在S期，抑制细胞增殖并诱导细胞调亡，通过进一步的实验和生物信息学分析，对NBS1下游调控的靶点基因及通路有了初步的了解。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章前言

第一节肝细胞癌概述

第二节NBS1概述及其与肝细胞癌的关系

第三节差异表达基因及通路分析

第二章NBS1基因多态性与HBV感染引起的肝细胞癌的相关性分析

第一节材料和方法

第二节结果

第三节讨论

第四节结论

第三章NBS1基因rs1805794 C／G多态性与癌症易感性的Meta分析

第一节材料与方法

第二节结果

第三节讨论

第四节结论

第四章抑制NBS1基因表达对HepG2生物学功能作用的研究

第一节材料和方法

第二节结果

第三节讨论

第四节结论

附录

参考文献

致谢

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