LncRNA HOTTIP通过调节p38--MAPK信号通路来促进糖尿病视网膜病变

摘要

糖尿病是一种由于胰岛素分泌不足、胰岛功能障碍导致的一种代谢性疾病。其特征是慢性渐进性的血糖升高。糖尿病是一种发病率很高的慢性疾病。目前，糖尿病根据病因不同，主要分为1型糖尿病，2型糖尿病，妊娠期糖尿病以及特殊类型糖尿病。其中，2型糖尿病最为常见。糖尿病严重危害了全世界人民的健康，据统计，中国2型糖尿病的发病率逐年上升。这可能与中国人民生活水平的提高、饮食结构的改变有相关性。同时，对于全球的儿童、青少年以及成人来说，糖尿病都是一个严重的威胁。大部分糖尿病人生活在发展中国家及中低收入国家，研究显示，目前中国的糖尿病发生率是11.6％，其中，男性发病率为12.1％，女性患病率为11％。这些患者中仅25.8％的病人接受了足够的治疗且血糖得到控制。糖尿病能够导致一系列的病理改变，如糖尿病能通过增加ROS，炎症反应以及对血管壁造成损伤，从而导致一系列的血管病变。糖尿病血管相关的并发症非常严重且种类多样，其主要包括多个器官及组织中的微血管以及大血管的病变，如肌肉、眼、皮肤、心脏、脑以及肾脏。糖尿病视网膜病变是大多数糖尿病人最常见的血管性并发症，也是糖尿病人致盲的最主要疾病。因此研究参与了糖尿病视网膜病变的发生、进展分子机制，找寻分子水平诊断、治疗DR的靶点是当前DR研究的热点。 在人类基因组中，只有少于2％的基因序列参与编码蛋白质，而超过98％的基因序列为非编码序列。其中，大部分这些序列转录的片段是非编码RNA。在这些非编码RNA中，具有超过200个核苷酸长度的是长链非编码RNA(lncRNAs)。LncRNAs在结构上和mRNA类似，但它不参加蛋白质的编码过程。它们能够在转录水平以及转录后水平调控编码蛋白质的基因的表达水平。长链非编码RNA的转录过程也经历RNA聚合酶转录，并通过加帽，剪切和加尾修饰的过程。LncRNA是RNA聚合酶的产物，曾经被认为无特异性生物学功能。但近期的一些研究表明，lncRNA参与了一系列的生物学过程，起着相应的调节作用。研究人员发现，lncRNA广泛地参与了体内很多重要的生物学功能，如表观遗传的调控，细胞周期的调控，以及多能干细胞重编码的凋亡和诱导等。另外，lncRNA还可以作为miRNA的前体，从而调节后者的功能。总的来说，lncRNA主要能够调节基因的表达，调节某些蛋白在细胞内的位置，与细胞亚结构结合等发挥其独特的生物学功能。LncRNA的异常表达也与许多人类疾病的发生进展有密切的联系，如心血管疾病和肿瘤等。在最近的相关研究中，针对人类β细胞转录组的研究发现，在人类2型糖尿病中lncRNA能够被动态调控以及表达异常。全基因组关联研究显示，lncRNA-ANRIL与2型糖尿病密切相关。 HOXA末端转录本反义RNA(HOXA transcript at the distal tip,HOTTIP)是一种长链非编码RNA。它是从HOXA家族转录出来的，其被发现参与了很多疾病中的生物学调控过程。LncRNA HOTTIP最早被发现与机体远心端成纤维细胞中，其基因和HOXA13相邻，位于后者的上游330bp。其表达主要位于躯体远端，且表达较为保守。由于HOXA基因的5'端结构较为紧密，这导致了与其临近的HOTTIP基因与HOXA基因的多个序列极其靠近，这种空间结构上的接近也许与HOTTIP基因的调节作用有关。HOTTIP RNA可以和WDR5/MLL复合体相结合，从而作用于HOXA5'端。HOTTIP RNA还可以激活H3K3me3的转录过程，并在HOXA基因的激活过程中是必须的。研究发现，沉默HOTTIP基因抑制了HOXA5'端基因表达。且其抑制效果是与HOTTIP基因距离呈反比。即与HOTTIP基因距离最近的HOXA13以及HOXA11基因受到的抑制最强。多项研究表明，HOTTIP RNA与恶性肿瘤的发生发展具有相关性。如在胰腺癌、胃癌、结直肠癌等癌症中，HOTTIP的表达均出现异常。 LncRNA具有上述的调控靶基因的途径，其在眼病方面也被认为具有很多的调控作用。如在白内障中，lncRNA被认为参与其发病机制，白内障是一种能造成晶状体透明度降低直至致盲的严重眼疾，其发病率较高，主要为老年患者。有研究发现，在年龄相关性白内障中，lncRNA MIAT表达上调。对表达MIAT下降的晶状体细胞进行过氧化刺激，其活性也出现减弱。在另一种常见的眼病青光眼中，lncRNA也被证实参与其发病发展。青光眼的特征是以眼压的异常升高，并出现视神经萎缩和视野缺损，最终影响视力甚至致盲的疾病。在另一种难治性的眼病增生性玻璃体视网膜眼病(PVR)中，也发现了lncRNAs参与的证据。PVR是在视网膜的前后及玻璃体内出现细胞性的膜性结构，引起视网膜牵拉脱离或固定的一种疾病。研究发现PVR的发生过程中，视网膜色素上皮(RPE)细胞出现EMT时关键过程。有学者研究发现，在PVR病人体内的lncRNAMALAT1表达上调，且其表达水平和疾病的严重程度呈正比。糖尿病视网膜病变(DR)中，lncRNA也被证实参与其发生及进展。DR的发生机制非常复杂，可能牵涉到多种途径的相互作用和影响。有学者研究发现，高糖诱导的视网膜内皮细胞中lncRNA MIAT表达显著上调。 近年来的一些研究发现，LncRNA参与了糖尿病视网膜微血管病变的发生和发展的过程，这不禁提示了，HOTIP RNA是否参与了DR的病程进展，因为HOTTIP在视网膜病变中的具体生物学机制仍然不明确。本研究发现HOTTIP参与了视网膜病变的调控，这也为今后本疾病的预防和治疗提供了理论基础。 目的:本研究检测LncRNA HOTTIP在DR组织和细胞中的表达，以及其与视网膜内皮细胞的生物学行为之间的关系，试图寻找LncRNA HOTTIP参与DR调控的证据，进一步了解DR发生发展的机制。 方法:1、为了研究HOTTIP在糖尿病眼病中的作用，首先构建了糖尿病动物模型。向SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素STZ以诱导糖尿病。动物模型构建成功后，首先采用QRTPCR研究了HOTTIP在糖尿病动物模型中的表达的情况。 2、为了进一步深入研究下调HOTTIP在视网膜功能调节中的作用，进行了shRNA眼内注射实验。并用QRGPCR实验验证HOTTIP的表达是否下降。在构建完成糖尿病大鼠5个月后，为了检测糖尿病大鼠的视网膜炎症的情况，将HOTTIP shRNA注射入大鼠的眼内，使眼内的HOTTIP表达下调，采用了western blot方法检测了糖尿病大鼠视网膜中炎症蛋白ICAM-1、VEGF的表达。 3、为了进一步研究糖尿病诱导的HOTTIP上调的功能性，检测了HOTTIP下调在内皮细胞的生存能力中的作用。细胞系RF/6A购自ATCC(ATCC，Manassas，VA，USA)。使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养。接下来，为了研究HOTTIP是否调控了高糖诱导的凋亡进程，对RF/6A细胞分别添加了高糖基质和HOTTIP siRNA、siNC以及无添加对照。同时，也试验性地在RF/6A细胞中添加H2O2以模拟氧化应激环境同时也下调HOTTIP。 4、采用了Western blot实验去检测MAPK信号通路是否激活。为了进一步明确p38-MAPK信号通路和HOTTIP调控细胞之间的关系，在RF/6A细胞中添加p38的特异性抑制剂SB203580、ERK的特异性抑制剂U0126以及JNK特异性抑制剂SP600125，并观察细胞的生存能力改变。 结果:1、QRT-PCR实验结果表明，HOTTIP在STZ诱导的糖尿病大鼠的视网膜中表达上调，与非糖尿病大鼠相比具有统计学意义。在2型糖尿病模式动物db/db小鼠的视网膜组织中，相比同年龄的对照组小鼠，HOTTIP的表达显著增强。QRT-PCR实验表明HOTTIP shRNA显著降低了HOTTIP的表达，而shRNA NC则未改变HOTTIP的表达。 2、采用了western blot方法检测了糖尿病大鼠视网膜中炎症蛋白ICAM-1、VEGF的表达。结果表明，糖尿病导致了视网膜中ICAM-1、VEGF的表达显著上调。接下来，将HOTTIP shRNA注射入大鼠的眼内，结果表明，下调HOTTIP显著地减少了ICAM-1、VEGF在视网膜中的表达。 3、在转染了HOTTIP siRNA后，RF/6A细胞中的HOTTIP表达出现了显著下调。MTT实验结果显示，高糖和氧化应激环境能分别减弱细胞的生存能力。下调HOTTIP能显著减弱细胞在高糖和H2O2环境下的生存能力。 4、Western Blot显示下调HOTTIP导致了磷酸化p38的显著下调，然而，磷酸化的ERK1/2和JNK1/2的表达却没有明显变化。下调HOTTIP导致了p38-MAPK信号通路的激活。 5、在RF/6A细胞中添加p38的特异性抑制剂SB203580，结果表明，在抑制了p38表达后HOTTIP的过表达也受到了抑制，同时也导致了RF/6A细胞生存能力的提高。也在RF/6A细胞中添加了ERK的特异性抑制剂U0126以及JNK特异性抑制剂SP600125，然而，HOTTIP介导的细胞的生存能力却没有发生改变。 结论:1、糖尿病大鼠的HOTTIP表达上调，而且HOTTIP能够促进糖尿病视网膜的炎症反应，参与了糖尿病微血管病变的调节。 2、体外细胞培养中，HOTTIP能够减少RF/6A细胞的生存能力，在高糖下，HOTTIP加重了细胞的凋亡。 3、HOTTIP通过P38-MAPK信号通路调控视网膜内皮细胞，在糖尿病视网膜病变的发病机制中起重要作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分LncRNA HOTTIP在糖尿病模型小鼠体内的表达与功能研究

1材料和方法

结果

讨论

第二部分HOTTP通过p38-MAPK通路调控视网膜内皮细胞

1．材料和方法

2结果

讨论

结论

参考文献

文献综述 长链非编码IⅢA在糖尿病视网膜病变中的作用

致谢

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