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摘要
缩略词表
1．1．1深海生态环境
1．1．2蛋白酶简介
1．1．3 M23家族金属蛋白酶研究进展
1．1．4 S8家族丝氨酸胶原蛋白酶研究进展
1．1．5深海产蛋白酶细菌及其胞外蛋白酶研究进展
1．2立题依据与研究内容
1．2．1立题依据
1．2．2研究内容
第二章Pseudoalteromonas sp．CF6-2和Flavobacterium arcticumSM1502T胞外酶多样性
2．1引言
2．2材料和仪器
2．2．1菌株与培养基
2．2．2试剂和仪器设备
2．2．3数据库和分析软件
2．3实验方法
2．3．1菌株培养和鉴定
2．3．2全基因组测序
2．3．3全基因组数据分析
2．4结果与分析
2．4．2菌株CF6-2胞外酶多样性分析
2．4．3菌株SM1502T基因组概况
2．4．4菌株SM1502T胞外酶多样性分析
2．5讨论
第三章深海细菌Pseudoalteromonas sp．CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin表达的诱导机制
3．1引言
3．2材料和仪器
3．2．1菌株与培养基
3．2．2主要生化试剂、分子试剂和试剂盒
3．2．3主要仪器设备
3．3实验方法
3．3．3样品总RNA的提取和cDNA合成
3．3．4荧光定量PCR测定Pseudoalterin基因表达水平
3．3．5蛋白水平检测Pseudoalterin的表达
3．3．6 Pseudoalterin转录起始位点的确定
3．4结果与分析
3．4．2肽聚糖肽链部分对pseudoalterin的诱导作用
3．4．3肽聚糖肽尾或肽桥部分对pseudoalterin的诱导作用
3．4．4肽聚糖肽桥中有效诱导组分的确定
3．4．5甘氨酸诱导pseudoalterin表达的有效浓度范围
3．4．6蛋白水平检测甘氨酸对pseudoalterin的诱导作用
3．4．7甘氨酸对pseudoalterin诱导表达的条件优化
3．4．8 Pseudoalterin的转录起始位点
3．5讨论
第四章深海细菌Pseudoalteromonas sp．CF6-2遗传操作体系的建立及其胞外蛋白酶Pseudoalterin的成熟和分泌机制
4．1引言
4．2材料和仪器
4．2．1菌株和质粒，培养基及抗生素的配制
4．2．2主要试剂
4．2．3主要仪器设备
4．3实验方法
4．3．1P．sp．CF6-2遗传操作体系的构建
4．3．2 Pseudoalterin成熟辅助蛋白及P．sp．CF6-2中Ⅱ型分泌途径Gsp基因簇的预测
4．3．3 Pseudoalterin成熟辅助蛋白基因和gspE的敲除
4．3．4胞外发酵液酶活及Western blot检测Pseudoalterin含量
4．4结果与分析
4．4．1P．sp．CF6-2的遗传操作体系的建立以及基因pseudoalterin的敲除
4．4．2 Pseudoalterin成熟辅助蛋白单基因缺失突变株的构建及表型分析
4．4．3 Pseudoalterin成熟辅助蛋白多基因缺失突变株的构建及表型分析
4．4．4 Pseudoalterin成熟形式的定位
4．4．5 P．sp．CF6-2中Pseudoalterin的分泌途径分析
4．5讨论
第五章深海细菌Pseudoalteromonas sp．CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin的催化机制
5．1引言
5．2材料和仪器
5．2．1菌株与质粒
5．2．2主要试剂和试剂盒
5．2．3主要仪器设备
5．2．4培养基和抗生素的配制
5．3实验方法
5．3．1以假交替单胞茵为宿主构建Pseudoalterin表达体系
5．3．2 Staphylococcus warneri MCCC0423肽聚糖的提取
5．3．3蛋白酶Pseudoalterin与肽聚糖相互作用关键氨基酸残基的分析
5．3．4 Pseudoalterin突变体的构建及表达纯化
5．3．5肽聚糖酶活检测方法
5．3．6 Pulldown实验检测蛋白对底物的吸附作用
5．3．7蛋白质二级结构分析
5．4结果与分析
5．4．1以假交替单胞菌为宿主构建Pseudoalterin的表达体系
5．4．2 Pseudoalterin中参与结合和催化肽聚糖的关键氨基酸残基的预测
5．4．3 Pseudoalterin突变体的构建及表达纯化
5．4．4 Pseudoalterin突变体的性质分析
5．4．5 Pseudoalterin对肽聚糖的催化机制
5．5讨论
第六章深海细菌Pseudoalteromonas sp．CF6-2及其胞外蛋白酶Pseudoalterin的生态功能
6．1引言
6．2材料和仪器
6．2．1菌株
6．2．2主要试剂和原料
6．2．3主要仪器设备
6．2．4培养基的配制
6．3实验方法
6．3．6 Pseudoalterin-like蛋白酶的广泛性分析
6．4结果与分析
6．4．1 P．sp．CF6-2对其它细菌的裂解能力
6．4．2 P．sp．CF6-2与MCCC0423的非接触共培养
6．4．3 P．sp．CF6-2通过分泌Pseudoalterin捕食革兰氏阳性细菌
6．4．4 Pseudoalterin对MCCC0423细胞壁肽聚糖的裂解活性
6．4．5 Pseudoalterin降解MCCC0423细胞壁肽聚糖的产物分析
6．4．6P．sp．CF6-2捕食海洋革兰氏阳性细菌的机制
6．4．7 Pseudoalterin-like蛋白酶的广泛性分布
6．5讨论
第七章深海细菌Pseudoalteromonas sp．CF6-2产胞外蛋白酶Pseudoalterin的发酵工艺
7．1引言
7．2材料和仪器
7．2．1菌株
7．2．2主要试剂和原料
7．2．3主要仪器设备
7．2．4培养基的配制
7．3实验方法
7．3．1产酶发酵培养基成分的优化
7．3．2P．sp．CF6-2发酵产酶中最适通气速率和搅拌速度的优化
7．3．4 P．sp．CF6-2产蛋白酶Pseudoalterin的中试发酵
7．3．5弹性蛋白酶酶活测定
7．4结果与分析
7．4．1P．sp．CF6-2产Pseudoalterin发酵培养基成分的优化
7．4．2 P．sp．CF6-2产蛋白酶Pseudoalterin的小试发酵
7．4．3P．sp．CF6-2产蛋白酶Pseudoalterin的中试发酵
7．5讨论
第八章深海细菌Photobacterium sp．A5-7胞外蛋白酶P57的性质及其PA结构域的功能
8．1引言
8．2材料和仪器
8．2．1菌株
8．2．2主要试剂
8．2．3主要仪器设备
8．2．4培养基和抗生素的配制
8．3实验方法
8．3．2菌株A5-7分泌的蛋白酶P57的纯化
8．3．3蛋白酶P57的N端氨基酸序列分析
8．3．4蛋白酶P57的酶学性质
8．3．5蛋白酶P57的基因克隆和序列分析
8．3．6 PA结构域及其突变体的表达和纯化
8．3．7蛋白酶P57、PA结构域及其突变体对不溶性Ⅰ型胶原纤维结合能力的分析
8．3．8 PA结构域及其突变体圆二色谱分析
8．4结果与分析
8．4．1菌株A5-7的系统发育分析
8．4．2蛋白酶P57的纯化与性质分析
8．4．3蛋白酶P57的基因克隆和序列分析
8．4．4蛋白酶P57的PA结构域与胶原的结合能力
8．4．5 PA结构域与胶原结合的关键氨基酸残基
8．5讨论
全文总结与展望
参考文献
在读期间论文发表、专利申请以及获奖情况
致谢
