GRKs和β-arrestins在GPCRs信号转导中作用的实验研究

摘要

G蛋白偶联受体（Gprotein-coupled receptors, GPCRs）是迄今为止发现的最大的细胞表面受体超家族，可将多种细胞外物理性和化学性信号传递至细胞内，并通过与其它信号转导通路相互作用来调控各种生理功能。配体与GPCRs结合后，不仅能激活异源三聚体G蛋白，还可以引发G蛋白偶联受体激酶（Gprotein-coupled receptorkinases, GRKs）参与GPCRs的磷酸化。通常情况下，抑制蛋白（β-arrestins）会迅速与磷酸化的GPCRs结合，削弱受体通过G蛋白对刺激物的应答作用。本实验拟以孤啡肽受体（opioid receptor-like1 receptor,ORL1）及apelin受体（putative receptor protein related to AT1, APJ）为主要研究对象，分析GPCRs调节因子GRKs和β-arrestins在这两种受体信号转导中的作用，探讨GPC Rs信号转导的作用途径和作用机制，为临床治疗提供新的策略和药物靶点积累资料。
　　本实验采用分子克隆方法构建含人ORL1、APJ及其突变体以及GRKs的各种真核表达载体，转染人胚胎肾细胞（HEK293T细胞），利用生物发光共振能量转移（bioluminine-scence resonance energy transfer, BRET）、激光共聚焦扫描显微镜等技术实时、动态地研究活细胞中GRKs、β-arrestins与ORL1、APJ的相互作用特点。同时，借助酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测细胞表面受体表达水平，分析配体诱导的受体内化的特点。
　　基因测序证实，一系列的重组真核表达质粒，包括 ORL1-Venus、ORL1-Rluc、EGFP-ORL1、GRK2/3-Rluc以及APJ突变体APJ S335A-Rluc、APJ S345A-Rluc、APJ S348A-Rluc、HA-APJ S348A等均构建正确，可用于细胞转染。经BRET检测，给予ORL1特异性激动剂N/OFQ后，ORL1既可以与Gαi/o结合，又能与GRK3、β-arrestin2产生相互作用，但与细胞膜定位蛋白Kras（K-Ras）的作用则会明显减弱。BRET2结果显示，在apelin-13作用下，野生型APJ与GRK2和GRK5均可发生相互作用，突变体APJ S335A和APJ S345A出现与野生型类似的效应；而APJ S348A与GRK2和GRK5均不能产生BRET信号。ELISA实验表明：采用N/OFQ处理细胞30min后，细胞表面ORL1水平降低，尤其当GRK3或β-arrestin2存在时，ORL1受体水平降低更加显著（p＜0.01），ORL1出现明显内化；采用apelin-13孵育细胞30min后，野生型APJ出现明显内化，当β-arrestins存在时内化更显著；但突变体APJ S348A，即便有β-arrestins的存在，也未发现明显的内化现象。
　　采用BRET技术研究ORL1和APJ的信号转导特点时发现，ORL1和APJ存在BRET现象，可形成二聚体，结果显示此二聚化是配体非依赖性的。激光共聚焦显微镜技术和荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）检测也得到了一致的结果。
　　实验结果提示，激动剂作用下，GPCRs不仅可以通过G蛋白依赖的信号转导途径发挥作用，还可经由G蛋白非依赖的信号转导途径影响受体的脱敏、内化、移位、运输等过程。在N/OFQ作用下，ORL1可以迅速与Gαi/o偶联；随着时间的延长，ORL1与细胞膜逐渐分离，而与GRK3以及β-arrestin2的相互作用增强。GPCRs的C末端是与GRKs和β-arrestins结合的主要部位，丝氨酸/苏氨酸残基是主要的磷酸化位点。本研究表明，348位丝氨酸（S348）是决定APJ脱敏、内化的关键磷酸化位点，该位点用丙氨酸替代后受体的脱敏、内化会受到显著抑制。另外，本实验还首次初步证实了ORL1和APJ存在稳定的异源二聚化作用。
　　深入研究N/OFQ/ORL1系统和apelin/APJ系统的信号转导机制不仅可以帮助我们了解GPCRs信号转导通路的复杂性；同时，因为上述N/OFQ/ORL1系统和apelin/APJ系统在多种疾病的发生、发展过程中发挥关键作用，我们期待本研究中ORL1、APJ激活后信号转导通路的明晰能为疼痛、焦虑、心力衰竭、高血压等的临床治疗提供新的诊治途径，并为研发新型药物及其作用靶点提供实验依据。

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目录

一 前 言

1 G蛋白及G蛋白偶联受体

2. GRKs与β-arrestins在GPCRs信号转导中的作用

3 GPCRs的二聚化

4 蛋白质相互作用研究方法

5 课题的设计思路及目的意义

二 材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

三、结 果

1. 表达载体的构建

2. HEK293T细胞的培养与转染

3 生物发光共振能量转移（BRET）检测

4. 酶联免疫吸附实验（ELISA）

5. 激光共聚焦扫描显微镜观测

四、讨 论

1. GRKs和β-arrestins对ORL1及APJ的调节

2. APJ与ORL1的二聚化

3. 进一步研究计划

五、结 论

[参考文献]

综述

攻读学位期间发表的学术论文

致谢