两种牧草遗传多样性及逆境条件下甲基化水平分析

摘要

老芒麦和黄花苜蓿具有抗旱、耐盐、抗寒和粗蛋白含量高等特性，是具有极其丰富遗传育种价值的优良牧草。本研究在课题组前期工作的基础上，采用 SSR、酯酶同工酶、AFLP等分子标记技术，对供试老芒麦及黄花苜蓿材料的遗传多样性进行分析，并以MSAP技术对逆境胁迫后的两种牧草甲基化水平进行了研究。结果报告如下：
　　（1）20份老芒麦材料干旱胁迫前后的SSR分析：以筛选出的10对引物对老芒麦进行SSR-PCR扩增，总扩增带数115条，大小多集中在500-2000 bp之间，多态性带数为103条，占总条带数的89.6％，多态性信息含量（PIC）平均为0.368，SSR标记效率（MI）为3.87，20份供试材料间遗传相似系数介于0.39~0.85，遗传距离介于0.16~0.94，表明老芒麦有很丰富的遗传多样性。聚类结果表明产地相同的材料大多聚为一类但又不完全一致，干旱胁迫前后聚类结果差别较大。
　　（2）20份老芒麦材料干旱胁迫前后的酯酶同工酶分析：经聚丙烯酰胺凝胶电泳20份老芒麦共检出17个酯酶同工酶酶谱，多数材料间谱带表现出差异性。17个酶谱中多态性酶谱为16条，多态百分率为94.1%，迁移率为0.154-0.692，其中迁移率为0.462的谱带为20份材料所共有，一定程度上体现出其同源性。在基础酶谱处，不同老芒麦材料染色的深浅不一，表明其酯酶同工酶活性及含量存在一定差异，一定程度上体现出其多态性。供试材料间的遗传相似系数介于0.01~0.93，即遗传多样性较大，聚类结果与产地存在较大关系，但也有一些产地相同的材料未聚为一类。
　　（3）干旱胁迫前后老芒麦MSAP分析：综合SSR分析和酯酶同工酶分析的结果进而筛选出多态性较好的2份老芒麦材料，以多态性丰富、重复性较好的15对引物进行扩增，共检测出多态条带475条，其中甲基化条带为376，占79%，2份供试材料干旱处理0，4,6,8天的MSAP(%)均值依次为57.6%，64.1%，69%，77.6%，相较于对照，干旱胁迫4,6,8天的老芒麦材料总甲基化多态性分别为8.0%，14.4%和23.0%，即干旱胁迫后老芒麦基因组DNA甲基化多态性水平增加，且增加幅度与胁迫时间呈正相关。
　　（4）20份群体黄花苜蓿材料AFLP分析：15对AFLP引物共检测出533条带，其中多态条带396条，占74.3%，多态性信息含量PIC为0.364，标记指数为9.589，Nei’s基因多样性为0.2684，Shannon’s信息指数为0.3989，20份供试材料遗传相似系数介于0.651~0.812，遗传距离介于0.208~0.430，表明黄花苜蓿群体之间的AFLP模式存在一定差异，其遗传多样性较为丰富；在遗传聚类上，采集地相同或相近的材料大多趋于一类，但也有例外。
　　（5）个体黄花苜蓿AFLP分析：经筛选出的多态性较高、重复性较好的15对引物进行扩增，18份黄花苜蓿材料共检测出493条带，其中多态性条带376条，占76.3%，多态性信息含量PIC为0.328，标记指数为8.19，Nei’s基因多样性为0.2458，Shannon’s信息指数为0.3719，18份供试材料间遗传相似系数介于0.655~0.873，遗传距离介于0.136~0.423，可见，个体黄花苜蓿AFLP分析的指标、数据均低于群体样本，这表明群体内的个体材料生理、生态条件一致，遗传分化较小，遗传聚类结果同样表明生境相同的材料大多聚为一类，但并不完全一致。
　　（6）12份黄花苜蓿MSAP分析：从25对选择性引物中筛选出多态性丰富、重复性较好的10对引物，对12份黄花苜蓿进行扩增，结果显示：多态性条带190条，所有测试材料甲基化总带数平均为130.75条，MSAP百分率平均为55.6%，其中全甲基化百分率平均为62.9%。表明测试样本之间的甲基化模式存在一定差异，且甲基化水平较其他一些植物基因组甲基化水平高，体现出表观遗传修饰上的物种差异性。
　　（7）低温胁迫黄花苜蓿MSAP分析：从25对选择性引物筛选出的多态性丰富、重复性较好的10对引物，对低温处理的黄花苜蓿进行扩增，共扩增出多态性条带189条，6份黄花苜蓿材料甲基化总带数平均为154条，MSAP百分率平均为81.6%，其中全甲基化百分率平均为76.5%。经低温胁迫处理后，黄花苜蓿基因组甲基化水平明显升高。研究结果提示，DNA甲基化参与了黄花苜蓿低温胁迫的调控。

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第一章 文献综述

1.1 老芒麦的遗传多样性分析

1.2 黄花苜蓿的遗传多样性分析

1.3 分子标记在牧草种质资源研究中的应用

1.4 逆境胁迫下甲基化水平分析

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 仪器和药品

2.3 实验方法

第三章 结果与分析

3.1 干旱胁迫下老芒麦SSR分析

3.2 干旱胁迫前后老芒麦酯酶同工酶分析

3.3 老芒麦干旱胁迫前后MSAP分析

3.4 群体黄花苜蓿AFLP分析

3.5 个体黄花苜蓿AFLP分析

3.6 黄花苜蓿MSAP分析

3.7 低温胁迫黄花苜蓿MSAP分析

第四章 讨论

4.1 干旱胁迫前后老芒麦遗传多样性的SSR分析

4.2 干旱胁迫前后老芒麦酯酶同工酶分析

4.3 干旱胁迫前后老芒麦甲基化水平的MSAP分析

4.4 群体和个体黄花苜蓿材料AFLP分析

4.5 黄花苜蓿的MSAP分析

4.6 低温胁迫前后黄花苜蓿基因组甲基化水平分析

参考文献

附图

在校期间发表的论文和基金项目

致谢