Tac3/Tacr3在黑线仓鼠繁殖过程中的调控作用

摘要

动物的繁殖活动是由众多因子通过错综复杂的神经内分泌系统调节下丘脑-垂体-性腺轴活动的一个极其复杂的过程。动物为了获得最大的繁殖成功率，只在特定的季节进行繁殖活动，这种现象称为季节性繁殖。季节繁殖是影响动物种群数量波动的主要原因之一，Tac3/Tacr3在调节动物季节性繁殖活动中发挥着重要作用。Tac3编码神经激肽B(NKB），NKB是一种含有特定的十个氨基酸的多肽；Tacr3编码NK3R，NK3R是NKB的天然受体，属于视紫红质七次跨膜G蛋白偶联受体家族。黑线仓鼠（Cricetulus barabensis）是典型的季节性繁殖动物，具有春、秋两个繁殖高峰期，是研究动物季节性繁殖机制的理想模型。本研究以黑线仓鼠为材料，采用分子生物学方法和技术，检测Tac3/Tacr3在黑线仓鼠的不同组织、不同发育阶段及不同季节的差异表达，揭示Tac3/Tacr3系统参与动物季节性繁殖活动的调控机理，旨在从分子水平上探究黑线仓鼠种群数量的季节性爆发机制。
　　首先，以黑线仓鼠下丘脑为材料，采用普通PCR扩增的方法得到黑线仓鼠Tac3 cDNA序列396bp（GenBank登录号：KU519331），包括完整的编码区序列360bp；获得Tacr3 cDNA序列1256bp（GenBank登录号：KU519332），包括编码区序列1244bp。对其进行生物信息学分析，建构系统发育树。
　　Tac3编码119个氨基酸残基，前21个为信号肽区域，C末端含有一个高度保守的结构功能域，即特征性十肽-Asp-Met-His-Asp-Phe-Phe-Val-Gly-Leu-Met，是速激肽家族的典型特征。速激肽保守的羧基末端，是速激肽作用于受体的基本结构，这种进化过程中的高度保守性说明这一类肽在生命活动中有着不可替代的重要作用。Tacr3编码区长1244bp，编码414个氨基酸残基，对二级结构进行分析表明整体疏水性较强。SMART对所得氨基酸序列进行相关结构分析，发现该序列存在7个明显的高疏水区域，而这七个高疏水区组成七个完整的α螺旋结构域，属于典型的G蛋白偶联受体家族视紫红质亚家族。使用MEGA5.0软件对黑线仓鼠的Tac3/Tacr3核苷酸序列与中国仓鼠、金黄仓鼠、牛、人等多个物种的相应核苷酸序列进行比对，构建了系统发育树，所得结果与传统物种分类结果相一致。
　　其次，采用实时荧光定量PCR技术检测Tac3和Tacr3在黑线仓鼠不同组织器官、不同发育阶段、不同季节中的相对表达量，采用酶联免疫反应检测了不同发育阶段、不同季节黑线仓鼠血清中NKB/NK3R（Tac3/Tacr3表达蛋白）的浓度，探究该系统对繁殖活动的调控模式。
　　通过检测Tac3和Tacr3在组织器官间的差异表达，发现Tac3和Tacr3在黑线仓鼠下丘脑中表达量远远高于在肝、肾、脾等其他器官组织中的表达量（P<0.01），而且血清中蛋白含量在不同发育阶段差异并不显著（P>0.05），表明Tac3/Tacr3系统主要在中枢神经系统中发挥调控作用，下丘脑是Tac3/Tacr3系统作用的关键部位。
　　通过检测Tac3和Tacr3在不同发育阶段的差异表达，发现Tac3和Tacr3在雌性黑线仓鼠幼体时期表达量最高（P<0.05），在雄性黑线仓鼠亚成体时期表达量最高（P<0.05），推测该系统参与调控黑线仓鼠生殖活动的启动，而且时间上存在着雌雄异型，主要体现在发育时期变化上。
　　季节性差异表达检测结果表明，发现黑线仓鼠下丘脑中，Tac3在春秋季节的表达量显著高于夏冬季节（P<0.05），与GnRH的季节表达模式相一致，也与黑线仓鼠季节性繁殖规律相一致，推测Tac3的表达能促进GnRH的分泌，对黑线仓鼠的繁殖调控起到促进作用。雌性黑线仓鼠下丘脑中，受体基因Tacr3在夏秋季的表达量高于春冬季节（P<0.05），而雄性个体在春秋季节的表达量高于夏冬季节（P<0.05），这与GPR54（KiSS1受体)基因的表达结果大致相同，推测黑线仓鼠中Tac3/Tacr3系统与KiSS1/GPR54系统有着密不可分的联系。Tacr3在雌性黑线仓鼠的下丘脑中夏季表达水平最高（P<0.05），推断此现象可能与光照时长有关，Tacr3的表达能够显著的受到光照长度的正向调控。但是在卵巢中夏季的表达水平并不是最高，中枢和外周表现不一致，可能是由于复杂的生理调控机理造成的。
　　综上所述，本研究探究了Tac3和Tacr3在黑线仓鼠的不同组织器官、不同发育阶段及不同季节的差异表达模式，从分子水平探究了黑线仓鼠内分泌神经肽系统参与季节性繁殖的调控机制，为种群数量波动与暴发的遗传机制以及鼠害治理提供理论依据。

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第1章 文献综述

1.1 Tac3/Tacr3系统调控哺乳动物繁殖活动的研究进展

1.1.1 神经激肽B及其受体

1.1.2 Tac3/Tacr3基因差异表达与雌雄异型

1.1.3 Tac3/Tacr3系统与动物繁殖的关系

1.1.4 NKB与光周期的关系

1.2 黑线仓鼠的研究概况

1.2.1黑线仓鼠的总体研究进展

1.2.2 黑线仓鼠季节性繁殖调控的研究进展

第2章 研究目的与意义

第3章 材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 动物材料

3.1.2 实验药品、试剂

3.1.3 实验仪器设备

3.2 实验方法

3.2.1发情周期的鉴定

3.2.2 血清中NKB、NK3R浓度测定

3.2.3 组织总RNA的提取及浓度纯度检测

3.2.4 反转录合成cDNA

3.2.5 Tac3与Tacr3基因的引物设计

3.2.6 黑线仓鼠Tac3与Tacr3基因的序列扩增

3.2.7 琼脂糖凝胶电泳检测及回收

3.2.8 感受态的制备、连接、转化与筛选

3.2.9 黑线仓鼠Tac3与Tacr3基因的荧光定量引物设计

3.2.10 实时荧光定量PCR反应

3.3 数据整理与分析

第4章 结果与分析

4.1 黑线仓鼠Tac3、Tacr3基因的克隆

4.1.1 组织样品提取RNA的分析结果

4.1.2β-action、Tac3、Tacr3基因扩增电泳及测序结果

4.1.3 黑线仓鼠Tac3和Tacr3基因序列分析

4.2 黑线仓鼠Tac3、Tacr3系统进化分析

4.3 黑线仓鼠Tac3和Tacr3荧光定量结果分析

4.3.1 荧光定量引物筛选

4.3.2 Tac3和Tacr3 mRNA在不同组织器官中的相对表达量

4.3.3 Tac3和Tacr3 mRNA在不同发育时期的相对定量

4.3.4 Tac3和Tacr3 mRNA在不同季节中的相对表达量

4.4 激素测定结果

第5章 讨论

5.1 Tac3/Tacr3结构分析

5.2 Tac3/Tacr3系统进化分析

5.3 Tac3/Tacr3系统与繁殖的关系

第6章 结论

第7章 展望

参考文献

附录A

致谢