毛细管电泳电化学检测赤潮毒素及DNA错配分析

摘要

本工作将毛细管电泳电化学方法和酶联免疫分析相结合,以HRP为标记酶,选择高灵敏度的供氢体为底物,酶催化反应产物经毛细管电泳分离后用微电极进行安培检测,实现了麻痹性贝毒(PSP)、腹泻性贝毒(DSP)和记忆缺失性贝毒(ASP)三种赤潮毒素的快速在线检测,检测时间由常规免疫分析1 d以上缩短至几分钟,操作简便,试剂消耗量少,可满足现场检测要求。利用金属离子Hg2+与Ag+分别可以结合DNA双链中的两个T碱基与C碱基的性质,以二茂铁与Tris-HCl溶液为体系,实现了DNA单碱基错配的识别,并考察了不同错配位点的电泳分离度。全文共分为六章。
　　 第一章为绪论,简要地介绍了毛细管电泳技术的现况与前景,毛细管电泳电化学酶催化分析以及赤潮毒素的研究进展,并说明了本课题的意义及主要内容。
　　 第二章利用毛细管电泳电化学酶联免疫分析检测辣根过氧化物酶(HRP)。HRP催化H2O2氧化邻氨基酚(OAP)生成3-氨基吩嗯嗪(AP),AP在一定条件下发生氧还反应。通过电化学检测酶促反应产物AP间接检测HRP的含量。对HRP的最佳检测条件进行了优化,最后确定分离高压为15 kv,进样高压与进样时间分别是10 kv和6 s,缓冲溶液是pH=5.0浓度为1.0×10-2 mol·L-1的BR溶液。在此状态下,游离HRP检测限为1.09×10-12 mol·L-1(S/N=3),线性范围为2.3×10-12_3.5×10-10 mol·L-1。
　　 第三章通过竞争模式分离了麻痹性贝毒(PSP)和腹泻型贝毒(DSP)这两种赤潮毒素。实验中,将一系列不同浓度的PSP抗原标准品或实际样品(Ag)分别和定量的抗OA抗体、酶标抗原Ag*加入微富集管孵育过程中,酶标抗原Ag*与标准品或实际样品中的抗原同限量的抗体发生竞争反应,然后进样到毛细管中进行分离,过量的Ag*和免疫复合物[Ab-Ag*]依次到达酶促反应池后开始催化H2O2氧化底物的反应,从而在Pt电极上得到检测,可检测到两个电泳峰。该方法对PSP测定的线性范围为0.8～16.0 pg/mL,检测限为0.32 pg/mL,比酶联免疫吸附测定光度法(ELISA)法低5倍;对DSP测定的线性范围为1.0～50.0 pg/mL,检测限为0.40pg/mL。用所建立的方法对毒素感染贝类样品进行了测定,并与ELISA法进行了对照,二者相关性很好。
　　 第四章采用非竞争模式,HRP标记的记忆缺失性贝类毒素(ASP)抗体(Ab*)过量,样品溶液在孵育后既含有HRP标记的遗忘性贝类毒素抗体-抗原结合物[Ag-Ab*],又含有未反应的遗忘性贝类毒素抗体(Ab*),混合液中的遗忘性贝类毒素-酶标抗体复合物和剩余酶标遗忘性贝类毒素抗体根据迁移速率不同在分离毛细管中分成不同的区带并顺次进入反应毛细管中,经毛细管电泳分离后,分别在反应毛细管中催化缓冲液中的过氧化氢氧化底物邻氨基酚,生成具有电化学活性的物质3-氨基吩嗯嗪,进入电化学检测池进行检测,可检测到两个电泳峰。遗忘性贝类毒素的浓度不同,形成的遗忘性贝类毒素抗原抗体结合物的量不同,催化过氧化氢氧化邻氨基酚生成氧化产物3-氨基吩嗯嗪的浓度就不同,产生不同的电化学信号,由此可对酶标遗忘性贝类毒素.抗体复合物以及贝类样品中的遗忘性贝类毒素进行定量分析。利用非竞争模式分离了记忆缺失性贝毒(ASP),该方法对ASP测定的线性范围为5.0～500.0 pg/mL,检测限为.2.0 pg/mL。
　　 第五章将毛细管电泳与电化学分析相结合,实现了DNA单碱基错配的识别,并考察了不同错配位点的电泳分离度。利用金属离子Hg2+与Ag+分别可以结合DNA双链中的两个T碱基与C碱基的性质,当有Hg2+存在时,可以形成T-Hg2+-T相互作用;当有Ag+存在时,可以形成C-Ag+-C相互作用,从而实现单碱基T或者C错配DNA的检测。以二茂铁标记物,标记在ssDNA探针上,与靶DNA杂交,生成双链DNA(dsDNA),通过二茂铁的电化学性质应用于检测错配DNA。
　　 第六章将毛细管电泳与电化学发光相结合,初步探讨了将Ru(bpy)32+CE-ECL技术用于错配DNA的检测,以Ru(bpy)2(dcbpy)NHS为标记物,标记在ssDNA探针上,与靶DNA杂交,生成双链DNA(dsDNA),通过实验,得出运用0.02mol·L-1 pH为7.0的:PBS(含三丙胺浓度为0.02 mol·L-1)缓冲液,8 kV作为分离电压,10 kv和10 s作为进样电压和进样时间,1.1 v作为检测电势,900 v作为光电倍增管高压,采取较好的避光条件,可以对错配DNA进行较好的分离检测。检测单碱基错配的ssDNA的线性范围为4.0×10-8-3.0×10-6 mol·L-1,检测限达到1×10-8mol·L-1。