高通量测序技术挖掘NMJ发育与再生相关新型调控分子研究

摘要

神经肌肉接头（NMJ）是一种外周胆碱能化学突触，主要由三种细胞组成：运动神经元，肌纤维和雪旺氏胶质细胞。NMJ发育和损伤后修复的过程是一个复杂且精细的多分子参与调控过程。
　　为研究NMJ发育、成熟和再生过程中基因的表达变化，本课题建立了三种研究模型：（1）C2C12肌细胞分化成肌管细胞和AGRIN蛋白刺激肌管细胞模拟突触后膜形成ACHR聚集簇的模型；（2）生理状态下，新生和成年小鼠膈肌表面NMJ突触区和非突触区发育的模型；（3）小鼠臂丛神经去支配损伤后的肌肉组织的NMJ损伤修复再生模型。
　　基于这三种模型，利用Illumina深度测序法，对三种模型的基因表达水平进行差异统计和比对分析。对统计结果进行质量评估，发现样品的Clean reads、测序饱和度和mRNA打断的随机程度都符合要求。对符合要求的统计结果进行比对，并且对差异基因进行Gene Ontology和KEGG pathway分析。根据上述分析，对差异基因的细胞组成、参与的生物过程、发挥的分子功能和主要参与的信号通路进行了统计。统计发现各个样品中差异基因主要细胞组成是细胞膜、细胞器和胞外基质等；主要参与的生物过程是细胞基础代谢、细胞黏附和生物调控等；主要发挥的分子功能是蛋白结合作用和催化作用等。而差异基因富集的信号通路较为广泛，其中主要有：细胞黏附作用、细胞代谢、WNT信号和细胞外基质信号等。
　　基于以上统计分析，发掘出若干在NMJ发育、成熟和修复再生中可能发挥重要作用的信号分子。这些分子中有些分子的功能已经被前期的研究证明，如ACHR各个亚基；而有些信号分子的潜在生物学功能还需要进一步的实验研究加以证明，如miRNA、Smad家族、Ccnd1&Ccnd3、Laminin家族和Sfrp家族等。
　　综上所述，本课题通过对NMJ发育、成熟和再生三种模型表达差异基因的统计分析，搜寻到若干在NMJ发育、成熟与再生过程中可能发挥重要调控作用的关键信号分子。例如，LAMININα2蛋白及其结合糖蛋白DYSTROGLYCAN或整合素INTEGRINα7β1发生缺陷时可产生显著先天性肌无力症状，而测序结果发现在肌细胞分化之前和新生小鼠的膈肌突触区中Lamininα2基因高表达，猜测LAMININα2蛋白只在NMJ的早期发育阶段在突触后膜的肌肉组织中发挥关键作用。研究还发现Laminin家族的多种不同亚基在NMJ发育不同阶段表达水平具有显著的差异，这对进一步研究LAMININ蛋白在NMJ中的作用，以及研究先天性肌无力症状的具体发病机制和潜在治疗方案提供了方向。本课题对参与调控NMJ发育、成熟和再生的关键基因的挖掘工作不仅为理解NMJ发育的神经生物学基础提供了重要线索，也为神经再生和神经肌肉系统相关疾病的治疗提供了潜在的靶点。

目录

缩略词

第一章 前言

1.1神经肌肉接头（NMJ）

1.2深度测序

1.3研究的目的与意义

第二章 NMJ发育与再生相关实验模型的建立

2.1建立C2C12细胞诱导分化和ACHR聚集体外模型

2.2不同发育阶段小鼠膈肌NMJ模型的建立

2.3 建立小鼠臂丛神经去神经支配损伤与再生模型

第三章 利用深度测序方法挖掘NMJ发育与再生相关基因

3.1实验操作方法

3.2实验结果

第四章 NMJ发育和再生相关潜在重要基因的挖掘

4.1乙酰胆碱受体，乙酰胆碱酯酶和Musk基因的表达差异

4.2 WNT和TGF-β信号的表达差异基因

4.3 MicroRNA表达差异基因

4.4细胞黏附信号相关表达差异基因

4.5细胞外基质表达差异基因

第五章 总结与展望

参考文献

致谢

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