基于改进MILP模型的克雷伯氏杆菌最优可行代谢路径分析

摘要

代谢工程主要利用基因重组技术对细胞代谢途径进行有目的的改造，从而改善细胞的代谢特性，实现特定目标产物的高效生产。通量平衡分析（FBA）是代谢工程常用的理论分析方法，但目前只能求出一组最优代谢路径，如何得到所有可行最优代谢路径引起人们的高度关注。针对混合整数线性规划（MILP）算法求解所有最优可行解时搜索范围过大造成计算时间较长的问题，本文结合通量可变性分析（FVA），对MILP进行了改进，分别对不同规模的克雷伯氏杆菌转化甘油为1,3-丙二醇（1,3-PD）的碳中心代谢网络和基因组代谢网络进行了最优可行路径分析，以期对菌种的基因工程改造提供理论支持。本文主要研究内容如下： 首先结合通量可变性分析，将得到反应通量最小值可能为零的集合作为约束改进MILP算法，缩小了变量搜索范围，采用GAMS软件进行编程求解。根据大肠杆菌的简化代谢网络，分别利用MILP和改进MILP算法得到丙酮酸激酶缺乏的所有替代最优解，并与文献中的最优可行解进行了比较，验证了算法的准确性和可行性。 然后根据克雷伯氏杆菌碳中心代谢网络，分别建立了微氧和厌氧下克雷伯氏杆菌的改进MILP模型，得到不同氧气消耗下的所有最优可行代谢路径数，并对可行代谢路径进行了ATP和关键节点分析。经过FVA改进的MILP模型与原MILP模型相比，在不同氧气消耗下可以获得更多的最优解个数。在微氧下经过最优可行路径分析，找到相同1,3-PD产率时ATP消耗最少的代谢路径，并且还原当量的转化成为消耗ATP的主要反应途径。随着氧气消耗的增大，甘油和二羟基丙酮（DHA）节点处反应途径的选择会发生变化。而厌氧下相同1,3-PD最大产率的最优可行代谢路径个数较少且1,3-PD最大产率偏低，并且糖降解途径是厌氧代谢网络提供ATP的主要反应途径。 最后针对基因组规模克雷伯氏杆菌代谢网络，先根据化学计量矩阵的行阶梯变换和代谢网络的FVA，对基因组尺度代谢网络模型进行简化，然后采用MILP模型和改进的MILP模型得到不同生物量和氧气消耗下的最优可行路径。针对基因组规模代谢网络，改进的MILP模型得到所有最优解的计算时间更少。随着生物量的增大，甘油节点处选择进入氧化途径的比例增大，DHA和烯醇式丙酮酸 （PEP）更倾向于消耗ATP的反应途径，并以ATP消耗总量最小作为次优目标，获得基因组尺度甘油产1,3-PD最大产率性能最优的代谢路径。

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1 文献综述

1.1 代谢工程简介

1.2 代谢网络研究进展

1.2.1 代谢网络概述

1.2.2 基因组尺度代谢网络的构建

1.2.3 克雷伯氏杆菌基因组尺度代谢网络的介绍

1.3 代谢网络分析方法

1.3.1 代谢控制分析

1.3.2 代谢通量分析

1.3.3 代谢路径分析

1.3.4 通量平衡分析

1.4 微生物发酵产1,3-丙二醇研究进展

1.4.1 1,3-丙二醇的物化性质和主要用途

1.4.2 微生物发酵生产1,3-丙二醇的优点

1.4.3 甘油生物转化为1,3-丙二醇的菌株

1.4.4 克雷伯氏杆菌生产1,3-丙二醇代谢工程的研究进展

1.5 本课题研究的目的、意义和内容

1.5.1 本课题研究的目的和意义

1.5.2 本课题研究的内容

2 混合整数线性规划算法的改进

2.1 引言

2.2 算法的介绍

2.2.1 线性规划最优值的求解

2.2.2 混合整数线性规划（MILP）

2.2.3 改进的混合整数线性规划

2.3 改进混合整数线性规划算法的应用

2.4 本章小结

3 克雷伯氏杆菌碳中心代谢网络最优可行代谢路径的分析

3.1 引言

3.2 微氧下最优可行代谢路径分析

3.2.1 微氧代谢网络模型的构建

3.2.2 微氧代谢网络通量平衡模型的建立

3.2.3 最优可行代谢路径的分析

3.3 厌氧下最优可行代谢路径分析

3.3.1 厌氧代谢网络模型的构建

3.3.2 厌氧代谢网络通量平衡模型的建立

3.3.3 最优可行代谢路径的分析

3.4 本章小结

4 克雷伯氏杆菌基因组代谢网络的最优可行代谢路径分析

4.1 引言

4.2 基因组尺度代谢网络模型的简化与算法

4.3 基因组代谢网络的最优可行代谢路径分析

4.3.1 生物量对最优可行代谢路径的影响

4.3.2 最优可行代谢路径的节点分析

4.3.3 最优可行代谢路径的ATP分析

4.3.4 氧气对最优可行代谢路径的影响

4.4 本章小结

5 结论与展望

参考文献

附 录

致 谢

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