食源致腐败菌群体感应信号分子及其抑制剂的毛细管电泳检测新方法研究

摘要

微生物腐败引起的食品变质问题使得人们在经济方面遭受到重大损失的同时也严重威胁到社会公共卫生安全。群体感应（quorum sensing,QS）系统的发现对研究如何控制食品腐败问题提供了新的方向。如何高灵敏、快速准确地检测QS信号分子及其抑制剂，是研究QS致腐机制和发展新型防腐策略的前提和基础。目前，QS信号分子的检测方法主要有构建生物报告菌、薄层层析、β-半乳糖苷酶法、比色法、GC-MS和HPLC-MS等。毛细管电泳（Capillary electrophoresis,CE）是一种新兴的液相分离技术，具有分离能力强、分析速度快、应用范围广、试剂消耗小和易于自动化等优点。但是由于毛细管电泳进样体积小、检测光程短、采用紫外检测时灵敏度较低等缺点限制了其在食品痕量污染物分析中的应用。群体感应效应可以通过抑制群体感应信号分子的产生来阻断，用于天然产物中酶激动剂抑制剂筛选的方法主要有分光光度法、放射性同位素法、薄层色谱法、电化学法、高效液相色谱法等，这些方法在某方面都有其局限性。由于CE分析时间短、耗样量少，可以实现反应在体系中连续进行等特点而被应用于酶抑制剂的筛选。鉴于此，本学位论文进行了如下研究： 1.建立场放大进样反向迁移胶束毛细管电泳检测群体感应信号分子的方法。实验中以N-Dodecanoyl-L-homoserine lactone、N-(3-Oxotetradecanoyl)-L-homoserine lactone、N-(3-Oxododecanoyl)-L-homoserine lactone、N-Decanoyl-L-homoserine lactone、N-(3-Oxodecanoyl)-L-homoserine lactone五种N-酰基高丝氨酸内脂（AHLs）信号分子为目标分析物，考察并优化了分离条件（乙腈浓度、异丙醇浓度、SDS浓度）和富集条件（进样电压、进样时间、水柱注入时间、样品中SDS浓度）。然后在优化后的实验条件下，我们进一步测定鱼、虾、CV12472和PA01中AHLs，并通过一系列方法评估，验证了此方法用于检测实际样品中AHLs的可行性。 2.为了进一步提高CE检测群体感应信号分子AHLs的灵敏度，我们建立了液液分散微萃取和MECC联用检测AHLs新方法检测实验。在此实验中，我们考察并优化了萃取率的影响条件（萃取剂的种类和用量、分散剂的种类和用量、破乳剂的种类和用量）和萃取条件（萃取时间、样品溶液中盐浓度），然后在优化后的实验条件下，我们进一步测定鱼、虾、CV12472和PA01中AHLs，并通过一系列方法评估，验证了此方法高灵敏度检测复杂基质样品中AHLs的可行性。 3.基于电泳中介微分析方法（EMMA）的分离机理，以5-脱氧-5-甲硫腺苷酶（MTAN）为靶标，建立了毛细管电泳筛选酶抑制剂的方法。在实验中考察并优化了分离条件（磷酸缓冲溶液的浓度和pH、HEPES缓冲溶液的pH、孵育时间、底物浓度、酶的用量、底物溶剂类型），并通过一系列方法证明了此方法用于MTAN抑制剂筛选的可能性。通过计算MTAN的米氏常数，进一步证明此方法用于MTAN抑制剂的筛选的可行性。然后对21种中草药和化合物对酶活性的影响进行了研究，实验结果表明，多种中草药对于MTAN与底物的反应有抑制作用，化合物中只有LD-14对MTAN有抑制作用，最后对LD-14的抑制机理进行了研究，进一步证明了此方法的能用于群体感应抑制剂的筛选。

目录

第一章 绪论

1.1群体感应现象概述

1.2群体感应效应与食品腐败的关系

1.3 AHLs类信号分子的研究方法

1.3.1色谱-质谱联用

1.3.2核磁共振法

1.3.3生物报告菌

1.3.4薄层层析法

1.3.5 比色法

1.4毛细管电泳简介

1.5酶促反应动力学及其抑制动力学原理

1.5.1米氏常数的意义及其计算原理

1.5.2酶的抑制动力学

1.6酶抑制剂的筛选方法

1.6.1放射性同位素法

1.6.2分光光度法

1.6.3薄层色谱法

1.6.4高效液相色谱法

1.7毛细管电泳在筛选酶抑制剂中的应用

1.8论文的研究目的和研究内容

第二章 场放大进样反向迁移胶束毛细管电泳检测群体感应信号分子

2.1引言

2.2实验部分

2.2.1仪器和试剂

2.2.2实验方法

2.2.3进样方式

2.3实验结果与讨论

2.3.1分离条件的优化

2.3.2富集条件的优化

2.3.3方法的效果评估

2.3.4实际样品分析结果

2.4本章小结

第三章 液液分散微萃取胶束电动色谱联用分析群体感应信号分子

3.1引言

3.2实验部分

3.2.1仪器和试剂

3.2.2实验方法

3.2.3实验步骤

3.3实验结果与讨论

3.3.1萃取率的考察与优化

3.3.2方法的效果评估

3.3.3实际样品分析结果

3.4本章小结

第四章 群体感应抑制剂的毛细管电泳筛选方法的建立及研究

4.1引言

4.2实验部分

4.2.1仪器和试剂

4.2.2实验方法

4.2.3进样方式

4.3实验结果与讨论

4.3.1群体感应抑制剂的毛细管电泳筛选方法的建立

4.3.2 抑制剂的筛选

4.4本章小结

第五章 结论与展望

参考文献

致谢

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