He-Ne激光照射对转CD59基因HeLa细胞调亡相关基因表达调控的作用研究

摘要

目的 构建突变CD59真核表达系统，获得高效表达CD59的HeLa细胞株。观测He-Ne激光照射对转基因HeLa细胞Fas、Bcl-2、NF-kB基因表达的影响。以证实CD59的抗凋亡作用。 方法 将含有CD59的重组pALTER-MAX质粒与PcDNA运用阳离子脂质体介导法共转染入HeLa细胞，用新霉素类似物(G418)筛选出阳性克隆，核酸原位杂交技术、酶免疫组化检测、筛选CD59基因高表达株。采用He-Ne激光体外直接照射及免疫组化方法检测He-Ne激光对细胞凋亡相关基因：Fas、Bcl-2、NF-kB、CD59表达的影响。将HeLa细胞、高表达CD59的HeLa细胞接种于小鼠背部脾区，24小时后激光照射脾区，第16天处死小鼠，取小鼠的胸腺、脾、肿瘤组织，用MTT法研究He-Ne激光对小鼠胸腺、免疫脾细胞的影响，用免疫组织化学技术检测对肿瘤组织的Fas、Bcl-2、NF-kB、CD59表达的作用及CD59抗凋亡的作用。 结果 成功构建CD59的真核细胞表达系统：运用阳离子脂质体介导法将含有CD59的PALTER-MAX重组质粒与PCDNA共转染入HeLa细胞，应用核酸原位杂交、固相酶联免疫吸附试验鉴定阳性细胞株CD59蛋白的高效表达。采用He-Ne激光直接照射体外培养的HeLa细胞、转染CD59基因的HeLa细胞，免疫组织化学染色显示激光照射HeLa细胞组(B组)Fas的表达明显高于未照射的HeLa细胞表达(A组)(t=8.237，P<0.05)，Bcl-2、NF-kB、CD59表达低于未照射的HeLa细胞表达(A组)(t=10.813，12.348，10.935，P<0.01)。照射转染CD59基因HeLa细胞组(C组)Fas表达量明显低于照射HeLa细胞组(B组)(t=7.259，P<0.05)，Bcl-2、NF-kB、CD59的表达高于照射HeLa细胞组(B组)(t=9.155，9.572，8.263，P<0.05)，差异有显著性。将HeLa细胞、转染CD59基因的HeLa细胞接种于小鼠背部脾区，成功构建小鼠肿瘤模型。激光照射小鼠脾区，用MTT法检测NK细胞的活性，激光照射后NK细胞杀伤K562细胞的活性明显增强。采用免疫组织化学技术检测He-Ne激光照射HeLa细胞组(Ⅱ组)Fas的表达量明显高于未照射组(Ⅰ组)(Z=-2.303，P<0.05)，Bcl-2、NF-kB、CD59表达明显低于未照射组(Ⅰ组)(Z=-2.843，-2.316，-2.305，P<0.05)。照射转染CD59基因HeLa细胞组(Ⅲ组)Bcl-2、NF-kB、CD59的表达明显高于照射HeLa细胞组(Ⅱ组)，差异有显著性(Z=-2.328，-2.367，-2.276，P<0.05)。 结论： He-Ne激光具有抑制肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡的效应。而CD59具有抗肿瘤细胞凋亡的作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章材料和方法

1.1材料

1.2方法

第二章结果

2.1重组质粒的酶切鉴定

2.3固相酶联免疫吸附试验(ELISA)

2.4CD59寡核苷酸探针鉴定阳性细胞克隆

2.5成瘤率及瘤体重量的比较

2.6免疫细胞杀伤活性的测定

2.7免疫细胞增殖活性

2.8免疫组织化学染色检测He-Ne激光体外照射对Hela细胞Fas、Bcl-2、NF-kB、CD59的表达的影响

2.9免疫组织化学染色检测体内肿瘤组织Fas、Bcl-2、NF-kB、CD59的表达

第三章讨论

结论

附录

参考文献

攻读学位期间的研究成果

He-Ne激光的临床应用及CD59分子研究的新进展 综述

致谢