腺相关病毒介导的CTGF和TIMP1双基因联合体外转染人退变髓核细胞的生物学效应观察

摘要

目的：构建人结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)和基质金属蛋白酶组织抑制因子1(tissue inhibitor of metaUoproteinases 1，TIMP1)基因的腺相关病毒(adeno associated virus，AAV)双表达重组质粒pSNAV<,2>-CTGF-IRES-TIMP1，体外检测生物学活性后进行病毒包装，并评价CTGF和TIMP1基因逆转人腰椎间盘退变的可行性。 方法：对构建的重组质粒pSNAV<,2>-CTGF-IRES-TIMP1进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序，用脂质体介导重组质粒转染人胚肾293(HEK293)细胞，通过双重免疫荧光、Western blot、MTT法和ELISA等方法检测细胞因子CTGF和TIMP1蛋白的生物学活性。在此基础上进行病毒颗粒包装。rAAV<,2>-CTGF-IRES-TIMP1感染体外分离培养并鉴定的人退变腰椎间盘髓核细胞，通过细胞形态学观察、氯胺T法、免疫组织化学法、<'35>S整合法以及Antonopoulos法等检测CTGF和TIMP1对于人退变腰椎间盘髓核细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成的影响。 结果：成功构建了含有完全正确的CTGF和TIMP1基因序列的AAV重组质粒。包装出的具有生物学活性的rAAV<,2>-CTGF-IRES-TIMP1病毒能够感染人退变腰椎间盘髓核细胞。CTGF和TIMP1联合可以促进髓核细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成。 结论：腺相关病毒介导的CTGF和TIMP1可以通过促进髓核细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成来延缓或逆转腰椎间盘退变。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一部分pSNAV2-CTGF-IRES-TIMP1双表达质粒的活性检测及包装

材料和方法

一、材料

二、方法

三、结果

第二部分CTGF和TIMP1双基因联合体外转染人退变髓核细胞的生物学效应

材料和方法

一、材料

二、方法

三、结果

讨论

结论

参考文献

文献综述:基质金属蛋白酶及其抑制因子与腰椎间盘退变

攻读学位期间的研究成果

附录

致谢