IL-12修饰的小鼠乳腺癌细胞EMT6/IL-12抗肿瘤作用研究

摘要

目的：获得可以稳定表达hIL-12蛋白的小鼠乳腺癌细胞株EMT6/IL-12。通过对EMT6/IL-12荷瘤小鼠进行肿瘤生长观察及免疫指标检测，探讨其抗肿瘤作用及其机制。 方法：将重组人IL-12真核表达载体pcDNA6/v5-his-p70(pcDNA-p70)转染入小鼠乳腺癌细胞EMT6，经筛选获得稳定转染克隆EMT6/IL-12，并进行表达鉴定。昆明小鼠随机分成三组，1组：EMT6/IL-12组，2组：pcDNA6-p70组，3组：EMT6组。于小鼠右胸皮下接种肿瘤细胞，1组接种EMT6/IL-12细胞，2、3组接种EMT6细胞。于接种肿瘤细胞后的第4、7、10、14、17天给予瘤内注射药物，1、3组注射生理盐水，2组注射pcDNA6-p70质粒。于第21天处死小鼠，剥取瘤体、脾脏和胸腺并称重；分别计算抑瘤率、脾指数和胸腺指数。检测脾淋巴细胞杀伤活性；脾淋巴细胞增殖反应；血清IFN-Y水平；ConA刺激后的脾淋巴细胞CD4/IFN-γ，CD8/IFN-γ双标记阳性细胞的百分率。 结果：EMT6/IL-12可以表达较高水平hIL-12蛋白。EMT6/IL-12组荷瘤小鼠抑瘤率(97.08％)较pcDNA6-p70(76.25％)及EMT6组提高(P＜0.01)；并且，EMT6/IL-12小鼠的脾及胸腺指数、脾淋巴细胞杀伤活性、脾淋巴细胞增生反应及血清IFN-γ水平均高于对照组(P＜0.01)；CFC检测显示， EMT6/IL-12组脾淋巴细胞CD4/IFN-γ(7.49±0.05％)、CD8/IFN-γ(6.35±0.06％)双标记阳性细胞的百分率均高于pcDNA6-p70(CD4/IFN-γ：4.3±0.03％：CD8/IFN-γ：3.7±0.05％)及EMT6组(CD4/IFN-γ：2.054-0.04％；CD8/IFN-γ：1.26±0.03％)(P＜0.01)。 结论：本研究成功地获得可高效稳定表达hIL-12的EMT6/IL-12细胞株；IL-12修饰的小鼠乳腺癌细胞EMT6/IL-12表现出预期抗肿瘤作用。

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文摘

英文文摘

声明

引言

第一章材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂和耗材

1.1.2主要仪器

1.2方法

1.2.1制备无内毒素的pcDNA6-p70质粒

1.2.2 EMT6/IL-12阳性细胞株的建立及筛选

1.2.3 EMT6/IL-12细胞株的鉴定

1.2.4小鼠肿瘤模型的建立与治疗

1.2.5肿瘤生长曲线测定

1.2.6脾淋巴细胞增生试验(MTT法)

1.2.7脾淋巴细胞杀伤实验(乳酸脱氢酶释放)

1.2.8荷瘤小鼠外周血中IFN-γ水平

1.2.9细胞因子流式细胞(cytokine follow cytometry，CFC)检测

1.2.10统计学方法

第二章结果

2.1 EMT6转染及阳性克隆的鉴定

2.1.1 p70的PCR扩增

2.1.2 p70的RT-PCR扩增

2.1.3 ELISA方法检测hIL-12蛋白表达的结果

2.2 EMT6/IL-12荷瘤小鼠肿瘤生长情况

2.3 EMT6/IL-12对荷瘤小鼠细胞免疫功能的影响

第三章讨论

结论

参考文献

综述：IL-12抗肿瘤基因治疗的研究

攻读学位期间的研究成果

发表论文一

发表论文二

致谢