TIMP-2基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞基质金属蛋白酶2及其抑制剂的表达

摘要

目的：本研究通过构建携带基质金属蛋白酶2特异性组织抑制剂(tissueinhibitor of matrix metalloproteinase-2，TIMP-2)基因的真核表达载体，转染豚鼠巩膜成纤维细胞，观察其基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)及TIMP-2的表达，以探讨形觉剥夺性近视基因治疗的可行性，为寻找有效的预防和控制近视发展的方法提供依据。 方法：随机选取三色健康豚鼠，雌雄兼有，组织块方法体外培养原代巩膜成纤维细胞，免疫组织化学法进行波形蛋白的鉴定，取3-6代细胞进行实验。分子克隆构建携带TIMP-2基因的真核表达载体，脂质体转染豚鼠巩膜成纤维细胞12h、24h、48h、3d、5d、7d。采用MTT方法观察转染后细胞增殖能力，提取总RNA，二步法逆转录-聚合酶链反应检测MMP-2mRNA及TIMP-2mRNA的表达水平。 结果：豚鼠巩膜成纤维细胞原代、传代培养生长良好，波形蛋白鉴定阳性。转染组与对照组比较转染TIMP-2基因对豚鼠巩膜成纤维细胞有促增生作用。转染48hMMP-2 mRNA表达即开始减少，转染3d时表达明显减少达到高峰，转染5d-7d虽然减少但幅度较前降低，除转染12h与24h之间外，各转染组间MMP-2 mRNA表达差别有统计学意义(P<0.05)。转染48h时TIMP-2 mRNA表达即开始增加，转染3d时表达明显增加，转染5d-7d时表达继续增加，但增加的速率较前面降低，除转染12h与转染24h之间外，各转染组间TIMP-2 mRNA表达差别有统计学意义(P<0.05)。 结论：MMP-2/TIMP-2mRNA表达平衡的失调在近视发生的早期起着重要的作用，TIMP-2基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞能够抑制MMP-2 mRNA的表达，有可能会在一定程度上阻止近视发展中巩膜的组织丢失与重塑。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章 材料及方法

1.1主要试剂仪器及来源

1.1.1主要仪器及来源

1.1.2主要试剂及来源

1.1.3主要溶液配制

1.2实验方法

1.2.1豚鼠巩膜成纤维细胞的培养及鉴定

1.2.2质粒构建

1.2.3血球计数板计数

1.2.4 MTT转染不同时间细胞生长增殖能力测定

1.2.5TIMP-2基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞

1.2.6 RT-PCR检测TIMP-2、MMP-2mRNA的表达

1.2.7统计学处理数据

第二章 实验结果

2.1细胞培养状态及鉴定结果

2.2质粒酶切鉴定、测序结果

2.3 MTT法测定转染不同时间细胞生长增殖情况

2.4 RT-PCR检测TIMP-2、MMP-2mRNA表达结果

第三章 讨论

结论

参考文献

近视治疗的研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢