迷迭香酸对6-OHDA损伤大鼠多巴胺能神经元的保护作用

摘要

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是第二大神经系统退行性疾病，发病率仅次于阿尔茨海默病。该病多发于中老年人，65岁以上人群PD患病率近1.7％。随着社会的老龄化，该病的发病人数呈逐年递增趋势，已成为严重影响人民健康水平，阻碍经济发展的重大社会问题。PD最主要的病理改变为黑质致密带(substantia nigrapar compacta，SNpc)多巴胺(dopamine，DA)能神经元脱失及伴发的纹状体轴突末梢DA的耗竭。典型的临床表现为肌僵直、静止性震颤及姿势异常等症状。PD的确切病因和发病机制尚不清楚，可能与遗传因素、环境因素、氧化应激、炎症反应、黑质(substantia nigra，SN)铁聚积和细胞凋亡等多种因素有关。临床治疗PD首选药物为左旋多巴，尽管应用此类药物是目前最有效的帕金森病治疗方法。但是这些药物只在发病早期有效，长期使用伴有严重的副反应。因此寻找天然、高效、低毒的神经保护药已成为新的研究热点。
　　 迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)是一种水溶性的含多酚羟基的酸，1958年首选从迷迭香类植物(rosmarinius officinalis)中分离提取而得名。已有实验证明RA具有抗炎、抗氧化、螯合铁离子、清除自由基等多种生物活性。本实验室已经证实RA预处理MES23.5细胞能够拮抗MPP+对其的毒性作用，其保护作用的机制可能与其抗氧化及抗凋亡机制相关。为了进一步探讨RA对PD是否具有防治作用及对DA能神经元保护作用的可能机制。本实验应用了6-羟基多巴胺(6-OHDA)单侧损毁大鼠，制备帕金森病(PD)大鼠模型，从而观察了RA对受损大鼠黑质多巴胺(DA)能神经元的保护作用。应用高效液相电化学检测法(HPLC-ECD)，观察了6-OHDA予处理后，大鼠Str的DA的含量变化；应用免疫组织化学检测法，观察了大鼠SN区酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元细胞数目变化情况；应用Perls’铁染色方法，观察了大鼠SN区铁染色阳性细胞数变化情况；同时还应用行为学检测、RT-PCR技术观察了RA对这些改变的影响，为RA对PD治疗和预防提供了有价值的理论和实验依据。实验结果如下：
　　 1.与正常对照组相比，6-OHDA处理大鼠后，损毁侧Str的DA含量明显降低(P<0.05)，RA(20mg/kg)预处理组的DA含量与6-OHDA组相比，有明显升高(P<0.05)，具有统计学意义。
　　 2.在6-OHDA舜伤侧的大鼠黑质致密带，TH免疫染色阳性细胞数量显著减少，与正常相组比具有显著性差异，(P<0.01)具有统计学意义，而经RA(20mg/kg)预处理后，TH免疫阳性细胞数明显增多，与6-OHDA组比较有统计学意义(P<0.01)。
　　 3.6-OHDA损伤侧的大鼠黑质致密带，铁染色阳性细胞数与正常组相比显著增多，而经过RA(20mg/kg)预先处理以后，迷迭香酸能够有效抑制这种损伤效应，其SN区铁染色阳性细胞数量明显减少，经检验与单纯损伤组比较都具有统计学意义(P<0.01)。
　　 4.在行为学检测中发现，经过迷迭香酸RA(20mg/kg)预处理过后的大鼠旋转行为学检测试验，其旋转次数明显低于损伤组大鼠，经检验，其差别具有明显统计学意义(P<0.01)。
　　 5.经过迷迭香酸RA(20mg/kg)予处理大鼠后，大鼠Bcl-2 mRNA基因水平明显降低，Bax mRNA基因水平明显升高，Bcl-2/Bax比值下降，THmRNA基因水平明显升高，经单因素方差分析，各组间差别具有统计学意义(P<0.05)。
　　 上述结果提示，6-OHDA处理大鼠可引起典型的行为学改变，DA的含量明显降低，SN内铁含量升高，TH免疫阳性细胞数目显著减少，Bcl-2/Bax比值升高，而经RA预处理以后可明显拮抗上述变化，证明其保护机制可能是通过抗氧化应激、螯合铁离子实现的。本研究为应用RA防治帕金森病提供了有力的实验依据，为该药的新用途和进一步开发提供了实验依据。