GM-CSF和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建

摘要

目的：将人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)编码基因与EB病毒(EBV)即刻早期基因(BZLFl)进行融合，构建融合基因的重组腺病毒表达载体，旨在发挥融合基因编码产物GM-SCF增强抗肿瘤免疫，以及BZLF1诱导潜伏期EBV进入裂解期复制的作用，为协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞提供实验基础和理论依据。
　　 方法：逆转录-聚合酶链反应分别获得目的基因GM-CSF和BZLF1编码序列的cDNA，采用剪接式重叠延伸(spliced overlap extension，SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA编码序列进行连接，构建融合基因BZGM。将融合基因BZGM定向亚克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒，在原核细胞Ecoli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组，构建融合基因BZGM真核表达载体pAd-BZGM。经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vAd-BZGM。RT-PCR和Western blotting鉴定重组腺病毒感染人鼻咽癌CNE细胞的情况；MTT法检测腺病毒感染CNE后细胞的增殖情况。
　　 结果：①将目的基因GM-CSF和BZLF1构建成融合基因BZGM。②构建融合基因BZGM重组腺病毒表达载体pAd-BZGM，测序鉴定结果表明序列正确无误。③将真核表达载体pAd-BZGM转染293细胞，包装获得重组腺病毒vAd-BZGM。④Western blotting和RT-PCR结果显示重组腺病毒感染的CNE细胞可检测到融合基因和EBV早期基因BMRF1表达，表明该融合基因能够诱导病毒从潜伏期进入裂解增殖期。⑤MTR法检测显示重组腺病毒感染CNE细胞后抑制细胞增殖的作用与所设对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。
　　 结论：成功构建了GM-CSF和BZLF1融合基因BZGM重组腺病毒表达载体，并在293细胞中包装获得重组腺病毒vAd-BZGM，重组腺病毒vAd-BZGM可在靶细胞内稳定表达目的基因，可有效诱导潜伏状态EBV进入裂解期复制，进而抑制细胞的增殖，为进一步探讨BZGM的功能奠定了实验基础。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一章 材料与方法

1.1 仪器、试剂和耗材

1.2 目的基因的制备

1.3 构建GM-CSF和BZLF1融合基因BZGM

1.4 腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-BZGM的构建

1.5 在RecA+BJ5183宿主菌中构建重组子

1.6 重组腺病毒载体转染293细胞

1.7 重组腺病毒融合基因的表达

1.8 Western blotting检测外源基因的表达

1.9 重组腺病毒对EBV阳性CNE细胞的作用

第二章 结果

2.1 目的基因RT-PCR电泳结果

2.2 融合基因PCR电泳结果

2.3 融合基因的序列测定

2.4 重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-BZGM的鉴定

2.5 大肠杆菌RecA+BJ5183中重组腺病毒载体pAd-BZGM的构建

2.6 重组腺病毒载体的包装

2.7 EBV阳性CNE细胞中重组腺病毒的表达

2.8 Western blotting检测外源基因的表达

2.9 RT-PCR检测早期基因的表达

2.10 MTT检测结果

第三章 讨论

第四章 结论

参考文献

综述

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢