靶向抑制ATF5功能对紫杉醇诱导的SW1990细胞凋亡的影响

摘要

目的：
　　 1.研究人转录激活因子5(Activating transcription factor5，ATF5)参与紫杉醇诱导的胰腺癌细胞凋亡过程的可能分子机制。
　　 2.研究显性负抑制(Dominant-negative，D/N)ATF5的功能，对胰腺癌细胞株耐受紫杉醇药物敏感性的影响及其可能的机制。
　　 方法：
　　 1.RT-PCR和Western-blot检测胰腺癌细胞系Capan-2、SW1990、ASPC-1中ATF5表达情况，选取高表达细胞系进行试验。
　　 2.梯度浓度的紫杉醇(0 nM、50 nM、100 nM、200 nM)作用胰腺癌SW1990细胞系不同时间(0h、6h、12h、24h、48h、72h)后，MTT检测对细胞增殖的影响，计算IC50。
　　 3.选取100nM浓度紫杉醇，作用SW1990细胞不同时间(0h、12h、24h、48h)后，倒置显微镜观察形态学变化，并采用Annexin V/7-AAD双染法以及SR-VAD-FMK/7-AAD双染法流式细胞术检测细胞凋亡情况；同时采用RT-PCR技术检测紫杉醇作用不同时间后ATF5、BCL-2 mRNA表达变化。
　　 4.采用显性负抑制(Dominant-negative，D/N)技术在SW1990细胞内干扰ATF5功能，同时设立转染空载体的对照组，分别于转染后加入100nM的紫杉醇作用12h、24h、48h，流式细胞术检测细胞凋亡情况，研究显性负抑制联合紫杉醇作用对肿瘤细胞凋亡及药物敏感性的影响。
　　 5.检测显性负抑制ATF5功能后，下游基因BCL-2蛋白表达的情况，研究ATF5抑制凋亡、影响药物敏感性的可能分子机制。
　　 结果：
　　 1.ATF5在胰腺癌细胞系Capan-2、SW1990、ASPC-1中均有不同程度的表达。RT-PCR检测各细胞系mRNA比值ATF5/β-actin分别为0.2±0.06、0.26±0.04、0.36±0.05，Western blot检测蛋白表达ATF5/β-actin分别为0.33±0.09、0.35±0.08、0.60±0.01，均以SW1990细胞系表达最高，选取SW1990细胞系进行试验。
　　 2.MTT结果显示紫杉醇可抑制SW1990细胞增殖，计算IC50为115nM，选取100nM进行后续试验。100nM紫杉醇作用SW1990细胞后，12h镜下可见细胞皱缩出现凋亡，48h后大部分细胞脱落死亡。流式细胞术结果显示100nM紫杉醇可诱导细胞凋亡，并呈现时间依赖性。Annexin V/7-AAD双染流式细胞术显示，作用SW1990细胞12h、24h、48h的总凋亡率分别为13.296、19％、31.8％，相应对照组为7.4％、9.9％、9.6％，差别具有统计学意义(p<0.05)；SR-VAD-FMK/7-AAD双染法显示凋亡率分别为13.1％、16.8％、39.9％，相应对照组为9.0％、10.1％、11.0％，差别具有统计学意义(p<0.05)。
　　 3.RT-PCR检测结果显示，在100nM紫杉醇诱导的SW1990细胞凋亡过程中，ATF5和BCL-2 mRNA表达水平下降。在紫杉醇作用的48h时ATF5下降了26.1％；而BCL-2的表达水平下降了12.5％。
　　 4.采用显性负抑制技术抑制了SW1990细胞内源性ATF5，48h后与对照组相比细胞凋亡率升高了13.6％，与窄载体转染组(升高5％)相比差别均具有统计学意义(p<0.05)；Western blot检测BCL-2蛋白表达水平下降了39％，与空载体转染组(下降3％)差别有统计学意义。并且，显性负抑制联合紫杉醇作用后，与单用紫杉醇组相比(48h凋亡率升高18.6％)进一步增加了细胞凋亡比例(48h凋亡率升高25.7％)，提高了紫杉醇的敏感性。
　　 结论：
　　 1.ATF5及其下游基因BCL-2表达下调，参与了紫杉醇诱导的胰腺癌SW1990细胞凋亡过程。
　　 2.显性负抑制ATF5的功能，可提高胰腺癌细胞株对紫杉醇的敏感性。