人同源盒基因HOXB4真核表达载体的构建和鉴定

摘要

目的：本实验旨在从人脐血单个核细胞中扩增出HOXB4基因，并构建出人同源盒基因HOXB4的真核表达载体，为进一步探讨HOXB4基因对造血干细胞的增殖及自我更新的影响，并将其应用HOXB4扩增脐血干细胞中去，能为造血干细胞移植提供有效地干细胞来源。
　　 方法：应用逆转录-聚合酶链反应从人脐血干细胞中扩增出目的基因HOXB4编码序列的cDNA，并将HOXB4的PCR产物用EcoRI和BamHI双酶切后连接到用EcoRI和BamHI双酶切的带有EGFP编码序列和内部核糖体转入位点(IRES)的真核表达载体pIRES2-EGFP中，然后转化感受态大肠杆菌，再进行筛选扩增，并将筛选的重组质粒进行双酶切及测序鉴定，并转染293T细胞进一步鉴定载体可否应用。
　　 结果：成功从人脐血单个核细胞中克隆出HOXB4基因，并将其连接到目的载体pIRES2-EGFP中，双酶切和质粒测序结果证实连接正确，且基因的开放阅读框架正确，pIRES2-EGFP/HOXB4真核表达载体构建成功。
　　 结论：利用PCR，DNA重组等分子生物学技术，成功构建了pIRES2-EGFP/HOXB4双顺反子真核表达载体，为下一步的基因表达研究奠定了基础，有利于探讨HOXB4基因在造血干细胞的增殖和分化中的作用，从而为安全有效扩增造血干细胞提供了工具，为干细胞移植治疗血液系统疾病奠定了实验基础。