CD59分子在人T细胞抗原特异性活化中的作用研究

摘要

目的：运用RNA干扰技术使正常人CD4+或CD8+T细胞的CD59基因表达发生沉默,然后观察其对负载肿瘤抗原的DCs或抗CD3/CD28/CD59(或IgG2a)包被珠的刺激反应,探讨CD59分子在T细胞抗原特异性活化中的作用及相关机制。
　　 方法：用含IL-4和GM-CSF的DC无血清培养基诱导培养健康供者的贴壁PBMCs,负载肿瘤抗原后,加入TNF-α促进DCs成熟。将CD59-siRNA表达质粒siCD59和空质粒pSRNG分别转染PA317细胞,包装出逆转录病毒,用于感染悬浮的PBMCs。G418筛选病毒感染细胞后,利用免疫磁珠纯化分选出CD4+T细胞和CD8+T细胞。利用FACS检测、补体溶解试验和PMA刺激CD4+T细胞活化试验评估CD59-siRNA对CD59、CD3、CD28表达以及T细胞非抗原特异性活化能力的影响。为探讨CD59分子在T细胞发生抗原特异性活化中的作用,利用负载肿瘤抗原的DCs刺激siCD59-T细胞(表达CD59-siRNA的T细胞)和cCD59-T细胞(对照细胞,空质粒来源的逆转录病毒感染的T细胞),分别检测IL-2+CD4+T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞和CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞(Tregs)的频数以及CD4+或CD8+T细胞增殖强度。为了解CD59分子发挥抑制T细胞抗原特异性活化的机制,利用抗CD3/CD28/CD59(或其同型对照抗体IgG2a)包被微珠刺激CD4+或CD8+T细胞,在混合培养介质中加入(或不加)抗CD59单抗的情况下,检测细胞的增殖强度。
　　 结果：诱导培养的负载肿瘤抗原的DCs高表达CD40、CD83、CD86和HLA-DR等细胞成熟标志。在分选出的CD4+或CD8+T细胞中,GFP+细胞的比例＞95%。siCD59-T细胞CD59分子表达水平显著降低,对补体溶解的敏感性明显增强;对PMA刺激具有正常的活化反应能力,但对CD59分子交联的反应降低;CD3和CD28的表达没有明显变化。利用负载肿瘤抗原的DCs进行刺激时,CD4+或CD8+siCD59-T细胞的活化、增殖反应显著增强;CD4+siCD59-T细胞与CD4+cCD59-T细胞之间,CD4+CD25+FoxP3+Tregs增殖幅度无明显差别。用抗CD3/CD28/CD59包被珠进行刺激时,siCD59-T细胞表现出更强的增殖活性;在珠/T细胞培养介质中加入抗CD59单克隆抗体后,siCD59-T细胞和cCD59-T细胞的增殖反应均显著增强,同时,前者的增殖活性仍明显强于后者。用抗CD3/CD28/IgG2a包被珠进行刺激时,siCD59-T细胞和cCD59-T细胞的增殖反应没有明显差别:在珠/T细胞培养介质中加入抗CD59单克隆抗体后,二者的增殖反应无明显变化。
　　 结论：在TCR识别、结合抗原肽-MHC复合物时,CD59分子通过与抗原提呈细胞上的相应配体结合而抑制人CD4+或CD8+T细胞发生抗原特异性活化。CD59分子对人T细胞抗原特异性活化的抑制效应与CD4+CD25+FoxP3+Tregs的作用无关。