左卡尼汀对体外高糖培养鼠视网膜神经细胞的保护作用及机制探讨

摘要

目的:探讨左卡尼汀(L-carnitine，LC)对高糖损伤鼠视网膜神经细胞的保护作用及可能的机制。
　　 方法:选择出生1～3d的SD大鼠，取视网膜，0.125％的胰蛋白酶消化制备单细胞悬液后进行体外培养。倒置相差显微镜观察细胞生长形态，采用Thy1.1单克隆抗体和微管相差蛋白-2多克隆抗体(Map2)对培养4d的细胞进行鉴定。台盼蓝拒染实验观察不同浓度葡萄糖作用下视网膜神经细胞生长状况，并计算细胞存活率。待细胞达80％融合时进行实验分组如下:正常细胞培养组（对照组）、单纯LC组、高糖损伤组、LC保护组、N-乙酰半胱氨酸(NAC)，MTT法检测各组细胞活力;流式细胞仪测各组细胞内活性氧(ROS)水平;Hoechst33342染色观察各组细胞凋亡率;JC-1染色后采用流式细胞仪检测各组细胞线粒体膜电位的变化。
　　 结果:体外培养细胞免疫荧光双标鉴定显示大部分为Thy1.1及Map2阳性。通过台盼蓝拒染实验比较不同浓度葡萄糖及不同干预时间视网膜神经细胞存活率，最终选择30mmol/L葡萄糖干预48h建立高糖损伤模型。MTT结果显示高糖损伤组细胞活性显著下降（P＜0.01），左卡尼汀保护组细胞活力较高糖组显著提高（P＜0.01）。高糖损伤组ROS水平高于正常细胞组，差别有统计学意义（P＜0.01），LC保护组ROS水平显著低于高糖损伤组(P＜0.01)。高糖损伤组Hoechst33342染色可见大量细胞出现凋亡的形态学改变（如细胞核致密浓染、核固缩、边缘化等），细胞凋亡率显著高于正常组(P＜0.01)，LC保护组细胞凋亡率显著低于高糖损伤组(P＜0.01)。高糖损伤组线粒体膜电位较正常细胞组显著降低(P＜0.01)，而LC保护组较高糖损伤组线粒体膜电位显著升高(P＜0.05)。
　　 结论:左卡尼汀对高糖引起的视网膜神经细胞氧化应激损伤具有保护作用，其保护机制可能与其增强细胞的抗氧化能力、抑制细胞凋亡及改善线粒体功能有关。

目录

摘要

引言

第一章 实验材料与方法

1．1 实验动物

1．2 主要实验仪器和实验试剂

1．2．1 主要实验仪器和器械

1．2．2 主要实验试剂

1．3 主要指标与实验方法

1．3．1．SD大鼠视网膜神经细胞的原代培养

1．3．2 高糖模型的建立及实验分组

1．3．3 高糖条件下视网膜神经细胞台盼蓝拒染实验

1．3．4 四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活力

1．3．5 流式细胞仪检测细胞ROS

1．3．6 Hoechst33342染色检测细胞凋亡

1．3．7 流式细胞仪检测线粒体膜电位(△ψm)

1．4 统计学处理

第二章 实验结果

2．1 视网膜神经细胞形态学观察及鉴定结果

2．2 葡萄糖浓度及高糖模型的确立

2．3 左卡尼汀对高糖损伤视网膜神经细胞活力的影响

2．4 左卡尼汀对高糖损伤视网膜神经细胞内ROS水平的影响

2．4 左卡尼汀对高糖损伤视网膜神经细胞凋亡的影响

2．5 左卡尼汀对高糖损伤视网膜神经细胞线粒体膜电位的影响

第三章 讨论

3．1 视网膜神经细胞的原代培养

3．2 视网膜神经细胞的鉴定

3．3 高浓度葡萄糖对视网膜神经细胞的存活率及细胞活性的影响

3．4 左卡尼汀对视网膜神经细胞氧化应激的影响

3．4 左卡尼汀对视网膜神经细胞凋亡的影响

结论

参考文献

附图

综述

攻读学位期间的研究成果

致谢

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