杀松材线虫海洋细菌的分离、鉴定及其活性物质的分析

摘要

松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus(Steiner&Buhrer) Nickle]是危害松属植物的重要病原物。寻找具有杀线活性的微生物并对其活性代谢产物进行研究，是开发效果好、毒性低和环境相容性好的微生物源杀线虫剂的一条重要途径。为筛选对松材线虫具有较强杀线活性的海洋细菌，本文对采自于青岛近海海域的样品进行细菌分离，得到49株细菌，以松材线虫为靶标线虫，采用浸渍法对这些菌株的培养液进行杀线虫活性测定，从中筛选出5株具有较高杀线活性的海洋细菌，这5株细菌的培养上清液对松材线虫处理24 h后校正死亡率均高于80％。
　　结合形态学观察、生理生化特征测定以及16S rDNA序列分析结果，将5个菌株分别鉴定为海假交替单胞菌（Pseudoalteromonas marina）、产黑假交替单胞菌(P.nigrifaciens)、Vibrio atlanticus、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和印度芽孢杆菌（B.indicus）。采用单因素法分析菌株H-42、S-16和G-23的最佳培养条件，结果表明，3个菌株产杀线活性物质的最适起始pH分别为7.0、6.0和8.0，最适培养温度分别为15℃、20℃和25℃;3个菌株的最适接种体菌龄、培养时间和培养基海水浓度分别为19 h、3d和100％。对菌株H-42和S-16的杀线活性物质组分的研究表明，两株细菌的培养上清液的挥发物粗提液具有很强的杀线活性，在24 h内的杀线活性高达100％。经SPME-GC/MS(solid-phase microextraction-gaschromatography/mass)分析和鉴定，杀线活性挥发物成分主要为dimethyltrisulfide(LC90=0.060 mmol/L), benzaldehyde(LC90=0.309 mmol/L), dimethyl disulfide(LC90=0.162 mmol/L),tert-butylamine(LC90=0.366mmol/L)。对菌株G-23所产杀线虫活性物质的稳定性进行研究，其产生的杀线虫物质热稳定性较好，既有极性小的物质也有水溶性物质，在弱碱性(pH8.0)条件下活性较稳定。
　　该研究可为海洋微生物活性物质的开发利用以及研发新型微生物源杀线虫剂提供重要的理论依据。