EBV相关淋巴瘤中病毒基因多态性的研究

摘要

目的：EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)在人群中感染非常普遍，参与多种人类肿瘤的发生，如Burkitt’s淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma,BL)、何杰金病(Hodgkin’s disease，HD)、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)以及胃癌等，其中与淋巴瘤的密切相关性已被确认。EBV相关肿瘤的分布具有明显的地域性和人群倾向性，除环境因素和遗传因素外，与EBV相关肿瘤有关的EBV基因变异一直是倍受关注的热点问题。中国是淋巴瘤的高发区，本研究选择青岛地区EBV阳性淋巴瘤作为研究对象，对肿瘤组织中EBV分型和病毒基因多态性进行检测分析，探讨我国非NPC高发区EBV阳性淋巴瘤组织中EBV基因型的分布以及是否存在与淋巴瘤发生相关的EBV基因变异，通过比较同一人种NPC高发区和低发区EBV基因多态性以及同一地区不同肿瘤间EBV基因多态性，揭示EBV基因多态性与EBV相关肿瘤发生的关系以及EBV相关肿瘤地域性分布的原因。
　　方法：①收集青岛地区354例石蜡包埋淋巴瘤标本，采用原位杂交技术检测石蜡切片组织中EBV编码小RNAl(EBV-encoded smallRNA1，EBERl)的转录以筛选EBV阳性淋巴瘤标本。②采用PCR、PCR-RFLP、巢式PCR及DNA测序等技术检测分析EBV阳性ENKTL标本中病毒1/2分型、C/D分型、F/f分型及LMP130bp缺失变异，并与当地NPC、EBVaGC和健康人群中EBV基因型的分布比较分析，免疫组化检测ENKTL(Extranodal NK/T-cell lymphoma,nasal type,ENKTL)组织中LMP1表达情况。③巢式PCR结合DNA测序检测EBV阳性淋巴瘤和NK/T细胞淋巴瘤标本中EBV即刻早期基因BZLF1、BRLF1和早期基因BARF1、BHRF1多态性，应用DNA Star软件对序列进行对比分析。与EBV标准株B95-8序列比较；根据各基因出现的突变情况进行分类分型，分析基因突变对相关基因功能的影响，同时与已发表文献中EBV基因多态性检测结果比对分析。
　　结果：①354例淋巴瘤标本中霍奇金淋巴瘤、成熟B细胞淋巴瘤、成熟NK/T细胞淋巴瘤以及前体淋巴肿瘤的EBV阳性检出率分别为39.1％(9/23)，1.44%(3/209)，69.4%(75/108)，0%(0/14)，共筛选出87例EBV阳性淋巴瘤标本，其中ENKTL标本67例。
　　②EBV阳性ENKTL组织中1、C、F型EBV的检出率分别为80.4%(45/56），66.1%(37/56）和87.5%(49/56），EBV阳性ENKTL中3种型别的分布与当地NPC和健康人群中的分布一致(χ2=2.939/5.626,P=0.060/0.230)，但与EBVaGC组织中C/D分型的分布差异显著(χ2=9.522,P=0.009)。
　　③LMP1C端成功扩增的48例ENKTL中有40例为Del-LMP1，占83.3%，8例为未缺失野生型LMP1。免疫组化检测62例ENKTL组织中LMP1表达，阳性率为59.7%(37/62)。LMP1表达与ENKTL发病部位相关(χ2=5.421,P=0.020)，但与年龄和性别分布等病理参数无相关性(χ2=1.698/0.193,P=0.193/0.360)。
　　④71例EBV阳性淋巴瘤标本中有26例BZLF1基因测序成功，检测到BZLF1-A、BZLF1-B和BZLF1-C3种BZLF1基因型，所占比例分别为34.6%、57.7%和3.8%，另有1例未归类标本；这包括BZLF1-A1、BZLF1-A2、BZLF1-B2、BZLF1-B3、BZLF1-B4和BZLF1-C6个亚型和1例“其他”亚型，比例分别为30.8%、3.8%、15.4%、3.8%、38.5%、3.8%和3.8%。所有BZLF1-B变异型均出现AA127位点的缺失突变，且在淋巴瘤中的分布显著高于其在EBVaGC、NPC和健康人TWs的分布(P<0.05)。BZLF1功能区中，反式激活区发生的突变最多，其次为bZIP区，BRLF1协同作用区未发现突变。
　　⑤71例EBV阳性淋巴瘤标本中有33例BRLF1基因测序成功，与B95-8标准序列比对，共发现19处错义突变和20处沉默突变。33例淋巴瘤标本中检测到BR1-A、BR1-C和BR1-E3个变异型，检出率分别为69.7%、27.3%和3%。与以往研究结果综合分析，发现EBV阳性淋巴瘤中BR1-C变异型的分布显著高于其在健康人TWs标本中的分布(P<0.05)，但与其在EBVaGC和NPC中的分布比较差异无显著性(P>0.05)。在BRLF1基因编码产物Rta蛋白功能区中，二聚体区域高度保守，DNA结合区域和反式激活区域均检测出序列变异；Rta蛋白16种CTL抗原表位中，只有NAA、QKE和ERP表位发生改变，且NAA和QKE在健康人群中突变率较高。
　　⑥47例EBV阳性NK/T细胞淋巴瘤标本BARF1基因测序成功，与B95-8原型株比较，大部分NK/T细胞淋巴瘤组织中BARF1基因序列未发生突变。34例标本BARF1核苷酸序列与B95-8原型株相同(72.3%，34/47)，38例标本(80.9%，38/47)BARF1编码产物与B95-8有相同的氨基酸序列。共发现BARF1基因7处错义突变和12处沉默突变，根据位于BARF1转化必需区域AA29V→A突变将BARF1变异型分为V29A，B95-8和“其他”3型。NK/T细胞淋巴瘤组织中各亚型的分布与其在EBVaGC(χ2=5.07，P>0.05)、NPC(χ2=4.77，P>0.05)和TWs(χ2=1.32，P>0.05)的分布无显著性差异。
　　⑦53例EBV阳性NK/T细胞淋巴瘤标本BHRF1基因测序成功，有51例(51/53,96.2%)标本检测到突变，共检测到11个位点的错义突变(AA14Ile→Val,24Thr→Ser,33Ala→Pro,63Glu→Lys,75His→Tyr,79Val→Leu/Met,88Leu→Val,101Ala→Thr,125Val→Ile,156Asp→Asn,157Asn→Thr)和3个位点的沉默突变(54586nt a→c,54615nt t→c和54711nt c→t)，其中沉默突变54615nt t→c几乎出现于所有标本(85%,34/40)。AA88Leu→Val变异见于大部分标本(77.4%，41/53)，AA79Val→Leu/Met变异出现频率也较高。根据AA88L→V和AA79V→L突变出现与否，分为79V88V、79L88L和79V88L3种变异型。各亚型在NK/T细胞淋巴瘤中的分布与其在TWs(χ2=4.80，P＞0.05)、EBVaGC(χ2=0.94，P＞0.05)和NPC(χ2=1.20，P>0.05)中的分布无显著性差异。除3例淋巴瘤标本在BHRF1基因Bcl-2同源区发生突变，其余标本均未发生突变。
　　结论：①EBV感染与淋巴瘤的发生密切相关。青岛地区EBV阳性ENKTL中1型、C型和F型EBV较为常见，以1CF连锁基因型为主。3种基因型综合分析发现，各基因型分布与当地NPC患者和健康人群EBV基因型的分布一致，C/D基因型在EBVaGC组织中的分布与其在EBV阳性淋巴瘤、NPC以及健康人群TWs中的分布有显著性差异，表明EBV基因型变异以地域局限性为主，兼有疾病相关性。
　　②Del-LMP1是青岛地区EBV阳性ENKTL中的主要LMP1变异型，说明LMP1C端缺失可能与ENKTL的发生密切相关。
　　③ENKTL组织中LMP1蛋白有较高的表达率，LMP1是参与ENKTL发生的重要致癌因子。
　　④BZLF1-A和BZLF1-B是青岛地区淋巴瘤中EBV的主要BZLF1基因型。BZLF1-A类型更多见于健康个体，具有AA127位点缺失突变的BZLF1-B基因型可能与淋巴瘤关系更密切。发生在ZEBRA蛋白反式激活区和bZIP区的突变可能对其功能产生影响。
　　⑤BR1-A和BR1-C是EBV阳性淋巴瘤组织中EBV的主要BRLF1基因型，BR1-C可能与鼻咽癌和淋巴瘤的发生有关。发生在Rta蛋白DNA结合区域和反式激活区域的突变可能对其功能产生影响；多数CTL表位序列保守提示BRLF1可以用作EBV相关疾病免疫治疗的靶基因。
　　⑥BZLF1和BRLF1两种基因变异型的相关性分析发现，BZLF1-B和BR1-C亚型间以及两种亚型与淋巴瘤的发生可能有着密切关系。
　　⑦EBV两种早期基因BARF1和BHRF1序列高度保守，这种保守对于维持基因功能和病毒的生物学活性至关重要。

目录

第一部分 EBV阳性鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤(ENKTL)组织中病毒分型的研究

Abstract

引言

第一章 材料与方法

第二章 结 果

第三章 讨 论

研究结论

参考文献

第二部分 EB病毒阳性淋巴瘤中病毒裂解期基因多态性分析

Abstract

引言

第一章 材料与方法

第二章 结 果

第三章 讨 论

结论

参考文献

综述：EB病毒核抗原与EBV相关疾病的关系研究进展

攻读学位期间的学术成果

致谢

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