联合下调SURVIVIN和KSP表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡影响研究

摘要

目的：实验和临床研究都证实，肿瘤细胞的生长繁殖与某些癌基因和抑癌基因的表达异常有关，其中特别重要的有SURVIVIN基因和纺锤体驱动蛋白(kinesin spindle protein，KSP)。SURVIVIN基因是近年发现的凋亡抑制蛋白家族新成员(IAP)。Survivin具有肿瘤特异性，在正常组织（胸腺，生殖器除外）细胞中水平低表达或不表达，但在胚胎组织和各种恶性肿瘤组织（如乳腺癌，胃癌、结直肠癌、肺癌等）中高表达，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关。由于Survivin的作用具有强大的调节细胞增殖以及抗凋亡的能力，因而成为近年来一个热门的肿瘤化疗的新靶点；KSP（也被称作Eg5），是驱动蛋白5(kinesin-5)亚家族中的一员。KSP在细胞有丝分裂早期对双极纺锤体的形成、复制、染色体的分离和中心体的分裂等有丝分裂过程发挥十分关键的作用。KSP除了在细胞有丝分裂过程中参与染色体的分离过程外，还与肿瘤的发生和发展密切相关。KSP在很多肿瘤细胞系中高表达，如乳腺癌、肺癌，所以KSP也已成为一个非常有吸引力的肿瘤化疗新靶点。理论上，抑制这些高表达的癌基因，就可以抑制癌细胞的繁殖或促使其凋亡。小RNA干扰（siRNA）技术具有特异性高、效果好、制备容易、操作简便等优点，而成为抑制基因表达的首选。以往的研究都是抑制单一基因的表达，也得到了较好的抑制肿瘤的效果。为强化效果，本研究拟联合转染survivin和KSP的siRNAs，同时抑制这两种基因在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达，研究对细胞的生长能力、侵袭能力的影响，为乳腺癌的基因治疗提供新策略。
　　方法：化学合成针对SURVIVIN和KSP基因mRNA的siRNAs，并加以适当修饰。选用纳米技术合成的原生质体转化试剂Entranster?-R为转染试剂，分别和联合转染乳腺癌细胞MDA-Mb-231，MTT测细胞增殖率，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，qRT-PCR和蛋白印迹法测mRNA和蛋白表达量。
　　结果：分别或联合转染两种基因的siRNAs后，对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制效果明显,但联合转染效果更好些。survivin和KSP mRNA和蛋白表达水平都显著下调(P<0.01)，在浓度达到100 nmol/L时干扰效果最好，在时间上，转染48 h后达到最佳效果。survivin、KSP和survivin+KSP三组转染的细胞增殖率分别为0.66±0.01、0.67±0.03、0.54±0.01。48 h对应的细胞凋亡率分别为（11.61±0.89）％、（16.33±0.94）%、（45.73±1.11）%，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。在各转染组中，survivin和KSP mRNA表达水平受到显著抑制(P<0.01)，BAX mRNA表达量增加显著（P<0.01），Bcl-2 mRNA表达量减少显著（P<0.01）。其中联合干扰组中，细胞增殖率最低、凋亡率最高、mRNA和蛋白表达量增加或减少最显著。
　　结论：利用siRNAs联合下调survivin和KSP基因表达，能有效抑制乳腺癌细胞的增殖、促进其凋亡，效果优于单个基因表达的下调。因此联合对survivin和KSP基因的干扰抑制是潜在的肿瘤治疗新方法，SURVIVIN和KSP可作为肿瘤治疗的有效靶点。

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引言

第一章 实 验 材 料

1.1 细胞株及培养体系

1.2 药品与试剂

1.3 材料与仪器

第二章 实 验 方 法

2.1 细胞制备与培养

2.2 siRNA设计合成

2.3 细胞转染

2.4 MTT测细胞生长抑制率

2.5 FCM检测细胞凋亡情况

2.6 RNA提取与RT-PCR

2.7蛋白印迹法分析SURVIVIN、KSP的蛋白表达量

2.8 统计学处理

第三章 实 验 结 果

3.1 siRNA干扰对MDA-MB-231细胞增殖的影响

3.2 各组细胞转染siRNA 48 h后的形态学观察

3.3 siRNA干扰对MDA-MB-231细胞凋亡的影响

3.4 siRNA干扰对mRNA和蛋白表达量的影响

第四章 讨 论

结论

参考文献

文献综述: siRNA抗肿瘤药物的研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢

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