跨膜衔接蛋白CBP及其棕榈酰化位点突变在CD59介导的T系白血病中信号转导的研究

摘要

目的：探讨跨膜衔接蛋白CBP与GPI锚固蛋白CD59在T细胞信号转导通路中的作用，进一步研究CBP与CD59在信号传递中的相互关系及作用机制，为白血病的治疗方面提供了相关的实验基础。
　　方法：选取Jurkat细胞系作为研究对象，构建CBP-EGFP慢病毒载体和CBP棕榈酰化位点突变-EGFP慢病毒载体，建立了稳定表达CBP-EGFP/CBP-M-EGFP的细胞系。使用CD59单克隆抗体分别刺激各组细胞，采用免疫荧光化学技术检测CBP、CD59在细胞上的表达及定位关系；光学显微镜下观察细胞的基础生长状态；电镜观察细胞内细胞器的复杂程度及超微结构的变化。流式细胞术检测细胞的基本参数及凋亡情况；CCK8法检测细胞的增殖效率。Western Blot检测与CBP结合的抑制性酪氨酸激酶CSK以及TCR活化通路中重要的信号分子LCK、FYN、PLCG1及ZAP70的表达。实时定量PCR检测了转染后CBP基因的表达情况，同时检测了T细胞信号转导通路中重要信号分子CD59、CSK、LCK、PLCG1及GRB2的表达。
　　结果：①激光共聚焦结果显示：共聚焦显微镜可见CBP、CD59分子定位于细胞膜上；CD59抗体交联刺激后，CBP-EGFP组可见CBP分子和CD59分子均呈戒指环状或点簇状高亮荧光分布，且分布区域存在交叉重叠，而CBP-M-EGFP组CBP分子与CD59分子在部分细胞中均出现点簇状聚集现象，但两者并不重叠。②光镜下发现转染CBP-EGFP病毒的Jurkat细胞皱缩细胞增多，大小均一性较差，以小个头细胞为主，CBP-M-EGFP组细胞形态大小不一，但以大个头细胞多见。③电镜可见转染后细胞内细胞器较Jurkat细胞复杂，有两组均出现自噬体样团块，但CBP-EGFP组较多，同时核质比降低、胞核变小、不规则，部分细胞器有肿胀现象。④实时定量PCR显示，转染病毒后，CBP基因在CBP-EGFP组和CBP-M-EGFP组的表达均上调。与CBP结合的抑制性酪氨酸激酶CSK基因表达量在CBP-EGFP组上调，在CBP-M-EGFP组是下调的。CD59、CSK、LCK、PLCG1及GRB2在CBP-EGFP组是下调的，而在CBP-M-EGFP组的结果则是相反的。⑤Western Blot显示,与CBP结合的抑制性蛋白CSK的表达量是增加的，CD59单抗作用以后CSK的表达量进一步增加；在CBP-EGFP组TCR活化通路中蛋白LCK、FYN、ZAP70表达量均下降，而CBP-M-EGFP组则是上升的。⑥CCK8结果显示，转染CBP-EGFP病毒载体后，细胞的活性和增殖效率明显下降；而转染突变了棕榈酰化位点的病毒载体，细胞活性增加，增殖效率上升。⑦细胞凋亡结果显示，CBP-EGFP组中，主要为早期凋亡细胞，比例为40％左右，中晚期凋亡细胞的比例在15%左右，CBP-M-EGFP组中，早期凋亡细胞和中晚期凋亡细胞均存在，早期凋亡细胞比例为25%左右，中晚期凋亡细胞比例为12%左右；CD59抗体交联后，CBP-EGFP组细胞凋亡数目明显增加，随着交联时间的延长，凋亡数目逐渐增加，CBP-M-EGFP组随着交联时间的延长，凋亡数目逐渐减少。
　　结论：高表达CBP能有效抑制Jurkat细胞的增殖，突变CBP棕榈酰化位点后抑制效果明显下降，同时利用CD59抗体交联，证实CD59可借助棕榈酰基团使CBP分子磷酸化,向细胞内传递抑制信号，引起TCR活化通路中一系列相关分子的变化，为探讨CD59与CBP在T细胞信号转导通路中相互作用奠定了基础,为探索T系淋巴细胞白血病发病机制提供了一定的实验数据，同时也为临床 T系白血病的诊断、防治提供了新的靶标。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

引言

第一章 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要实验仪器

1.1.2细胞株与病毒载体

1.1.3 抗体

1.1.4其他主要试剂

1.1.5常用液体的配置

1.2方法

1.2.1Jurkat细胞培养

1.2.2 Jurkat细胞病毒转染及转染效率的测定

1.2.3激光共聚焦显微镜观察细胞内CD59与CBP的定位

1.2.4 透射电镜

1.2.5实时定量PCR

1.2.6Western Blot

1.2.7 功能检测

1.2.8统计学分析

第二章 结果

2.1 Jurkat细胞的培养

2.2 Jurkat细胞病毒转染

2.2.1 相差显微镜观察转染细胞

2.2.2激光共聚焦显微镜观察病毒转染效率

2.2.3激光共聚焦显微镜观察抗体作用前后CBP的定位

2.2.4激光共聚焦显微镜观察CD59与CBP的定位及关系

2.3电镜观察细胞内的超微结构

2.4 实时定量PCR检测T细胞信号转导基因的表达

2.4.1 CBP与抑制性酪氨酸激酶CSK基因的表达

2.4.2 TCR活化通路中重要的信号分子基因的表达

2.5Western blot

2.5.1 抑制性酪氨酸激酶CSK与LCK的表达

2.5.2 TCR活化通路中重要的信号分子的表达

2.6功能检测

2.6.1 CCK8检测Jurkat细胞增殖

2.6.2 流式细胞术检测Jurkat细胞凋亡

第三章 讨论

3.1 跨膜蛋白CBP是在T淋巴细胞信号转导通路中起到抑制作用

3.2 GPI锚固蛋白CD59借棕榈酰化基团与CBP共同调节T淋巴细胞信号转导

结论

参考文献

综述: 跨膜衔接蛋白CBP在CD59介导的T系白血病中信号转导的研究进展

攻读学位期间的研究成果

附录

致谢

声明