PDGFR-a在C57BL/6J小鼠体外腭突悬浮培养融合过程中的表达变化

摘要

目的：有研究证实，在斑马鱼颌面部发育过程中，血小板衍生生长因子受体α（platelet-derived growth factor receptorα,PDGFR-α）与腭裂关系密切。在人类胎儿酒精综合征（Fetal Alcohol Spectrum Disorder，FASD）患者中进行血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）的基因组测序，数据表明PDGFR-α与FASD的颅面部表型密切相关，证实了PDGFR-α与颅面部发育机制相关。而PDGFR-α因子与先天性腭裂之间的关系研究至今鲜有报道。前期实验研究了正常小鼠胚胎腭突发育过程中，PDGFR-α在腭突内的时空表达变化。本实验拟以C57BL/6J小鼠为模型，进行小鼠腭突器官体外悬浮培养模型的构建，研究PDGFR-α因子在小鼠腭突体外旋转培养下不同时间段的表达变化。
　　方法：体式显微镜下进行腭突取材，应用悬浮培养法培养腭突。分别培养24、36、48小时，取出腭突甲醛固定后体视显微镜下观察并记录腭突发育情况，苏木素-伊红（HE）观察腭突不同发育时间段情况，运用免疫组织化学检测腭突体外培养不同时间段组织中PDGFR-α蛋白的表达定位；Western blotting检测腭突体外培养不同时间段组织中PDGFR-α蛋白的时空表达变化。
　　结果：
　　1.体视显微镜和苏木素-伊红（HE）染色结果均显示，在改进的体外腭突悬浮培养方法下，体外培养24h腭突与GD13.5天时相比较，双侧腭突向中线方向靠近生长；36h时，镜下观察到双侧腭突融合，HE切片观察到中嵴上皮缝的形成；48h时，HE观察到中嵴上皮缝消失，表明体外培养腭突完全融合。
　　2.免疫组织化学检测结果显示PDGFR-α在小鼠体外培养的腭突间充质和上皮中都有表达，在体外培养24h后，即相当于GD14.5天时，表达水平达到高峰，与前期实验体内正常发育的腭突的PDGFR-α表达水平变化一致；并与体外腭突培养的36h、48h蛋白表达水平相对比有明显的差异。
　　3. Western blotting方法检测PDGFR-α在腭突体外悬浮培养不同时间段的蛋白表达变化和免疫组化检测结果趋势一致；并与前期体内正常发育阶段PDGFR-α在不同时间段内蛋白表达趋势近似。
　　结论：本实验通过改进的体外悬浮培养腭突方法为研究腭裂发病机制提供了一个良好的体外腭突培养模型；PDGFR-α在体外培养腭突发育的关键时期均有表达，而且与前期体内实验相比较具有相似性。良好的体外模型的建立为后续腭裂发病复杂的机制研究奠定基础。

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引言

第一章 C57BL/6J小鼠胚胎腭突体外悬浮培养模型的构建

1.1 材料与方法

1.1.1 实验动物、试剂、仪器、耗材

1.1.2 活体组织培养仪

1.1.3 C57BL/6J小鼠腭突的取材及培养

1.1.4组织切片苏木精-伊红染色

1.2 结果

1.2.1小鼠胚胎腭突器官的体外培养融合过程中HE染色

1.2.2 小鼠胚胎腭突器官的体外培养体视显微镜观察

1.3 讨论

1.4 结论

第二章 PDGFR-α在C57BL/6J小鼠胚胎腭突体外旋转培养融合过程中的表达

2.1 材料与方法

2.1.1实验动物、试剂、仪器

2.1.2 免疫组织化学(IHC)方法检测 PDGFR-α 基因在小鼠胚胎体外培养的腭突中的表达

2.1.3 Western Blotting检测PDGFR-α在小鼠胚胎体外腭突器官培养融合过程中的蛋白表达变化

2.2 结果

2.2.1 PDGFR-α基因在C57BL/6J小鼠胚胎腭突体外旋转培养融合过程中的表达

2.2.2 PDGFR-α在C57BL/6J小鼠胚胎腭突体外旋转培养融合过程中的蛋白表达变化

2.3讨论

2.3.1 腭突的正常和异常的发生

2.3.2 PDGFR-α基因与腭突发育关系

2.4 结论

参考文献

综述:先天性腭裂异常胚胎发育的分子机制研究

附录

攻读学位期间的研究成果

致谢

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