微RNA-375通过抑制YAP基因表达调控CIK细胞对宫颈癌SiHa细胞的体外杀伤效应

摘要

目的：探讨微 RNA-375（microRNA-375，miR-375）参与细胞因子诱导杀伤（cytokine-induced killer，CIK）细胞杀伤宫颈癌SiHa细胞过程的调控作用，并确定miR-375发挥功能的靶基因及其分子机制。
　　方法：分离健康者外周血中的单个核细胞，在体外用多种细胞因子诱导培养14d后获得CIK细胞。收集CIK细胞用作效应细胞，FCM法分析其免疫表型，并采用CCK-8法测定CIK细胞对宫颈癌SiHa细胞的杀伤效应。实时荧光定量PCR法检测CIK细胞共培养前后宫颈癌SiHa细胞中miR-375的表达水平。CCK-8法检测miR-375模拟物转染后SiHa细胞的活性变化，以及CIK细胞共培养对转染miR-375抑制子后SiHa细胞的生长抑制作用。细胞免疫荧光法和蛋白质印迹法检测与CIK细胞共培养后，转染miR-375抑制子的SiHa细胞中Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）的表达情况。
　　结果：与CIK细胞共培养24、48和72h后，SiHa细胞的生长抑制率分别为（22.97±3.54）％、（37.48±3.64）%和（54.32±4.25）%，SiHa细胞中miR-375的相对表达量分别约为共培养前的1.39、1.57和2.68倍。转染miR-375模拟物后，SiHa细胞的活性显著降低（P＜0.001）。转染miR-375抑制子后，CIK细胞抑制SiHa细胞生长的效应显著降低（P＜0.001）。YAP蛋白在SiHa细胞中大量表达，且主要集中于细胞核。与CIK细胞共培养后，转染miR-375抑制子的SiHa细胞中YAP蛋白表达显著上调（P＜0.01）。
　　结论：
　　1.CIK细胞对宫颈癌SiHa细胞的增殖具有抑制作用，且在一定的时间范围内随着作用时间的延长，细胞抑制作用显著增强；
　　2.miR-375可能在宫颈癌的发生和发展中起到抑瘤作用；
　　3.CIK细胞可上调宫颈癌SiHa细胞中miR-375的表达水平，miR-375可能在CIK细胞杀伤SiHa细胞的过程中起重要作用。
　　4.miR-375可能通过靶向抑制YAP基因表达，在CIK细胞杀伤SiHa细胞过程中起一定作用。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

专业名词缩写中英文对照

引言

第一章 材料与方法

1.1 细胞株

1.2 主要试剂

1.2.1 细胞培养相关实验材料

1.2.2 CIK细胞诱导相关实验材料

1.2.3 CCK8实验材料

1.2.4 细胞转染实验材料

1.2.5 实时荧光定量PCR实验材料

1.2.6 免疫荧光实验材料

1.2.7 Western blot实验材料

1.3 主要仪器

1.4实验方法

1.4.1 细胞培养

1.4.2 细胞诱导

1.4.3 CCK-8法检测细胞的杀伤效应

1.4.4 实时荧光定量PCR

1.4.5 细胞转染

1.4.6 CCK-8法检测SiHa细胞生长情况

1.4.7免疫荧光法

1.4.8 蛋白质印记

1.5 统计学方法

第二章 实验结果

2.1 CIK细胞可抑制SiHa细胞增殖的验证

2.1.1 诱导获得CIK 细胞及其免疫表型鉴定

2.1.2 CIK 细胞共培养对SiHa 细胞增殖的抑制作用

2.2 CIK细胞对SiHa细胞中miR-375表达的影响

2.3 miR-375可能在CIK细胞抑制SiHa细胞增殖活性的过程中起到重要作用的验证

2.4 YAP基因可能作为miR-375的靶点在CIK细胞增殖活性的过程中起到重要作用的验证

第三章 讨 论

结论

参考文献

综述:MiR-375在妇科肿瘤中的研究进展

硕士在读期间发表的论文

致谢

声明