CRISPR/Cas9技术在氟喹诺酮C-7位取代基作用机制探究中的应用

摘要

近年来，由于氟喹诺酮类药物的大量使用，导致越来越多的耐药突变菌被发现，这使得研究细菌耐药性产生机制、开发更优良的杀菌剂成为了整个医疗界的重要任务。目前，氟喹诺酮类药物性能的提升主要通过修饰母核C上的取代基来实现，其中C-7位取代基可变性强，在新药开发中有着较好的运用前景，因此研究C-7位取代基在氟喹诺酮杀菌过程中的作用机制有着重要意义。另外，据前期研究发现，氟喹诺酮C-7环末端恰好落在gyrB466处，但由于还未获得466位单突变体，所以目前还没能真正揭示两者之间的作用关系和强度。
　　CRISPR/Cas9是一项高效准确的新兴基因编辑技术，其在基因功能的研究中具有重要作用。本论文通过使用 CRISPR/Cas9技术和λ-red同源重组技术构建了gyrB466C突变体，并对突变体进行了药敏性检测，以分析 gyrB466位氨基酸与氟喹诺酮类药物的作用情况，实验主要的内容和结果如下：
　　通过构建CRISPR/Cas9基因编辑系统和λ-red同源重组系统，成功的将编码大肠杆菌MG1655 gyrB466位氨基酸的碱基GAA替换为了TGT，其中，替换效率达到了100％。后对获得的gyrB466单突变体进行了环丙沙星药敏实验，实验结果表明：突变型菌株的最小抑菌浓度（MIC）是野生型菌株的4倍，药物动力学实验表明，其绝对致死浓度（LD100）为0.2μg/ml，为野生型菌株的4倍，且同浓度环丙沙星对突变型菌株的杀菌效率明显降低。实验结果表明：gyrB466位氨基酸与环丙沙星具有相互作用，其突变会降低环丙沙星的杀菌性能。

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引言

第1章 绪论

1.1 喹诺酮类药物及其发展简介

1.2 喹诺酮类药物的作用机制

1.3 大肠杆菌耐喹诺酮类药物机制的研究进展

1.4 基因编辑技术研究进展

1.5 新兴基因编辑技术CRISPR/Cas9简述

1.6 研究目的和内容

1.7 研究意义

第2章 基于CRISPR/Cas9技术的大肠杆菌gyrB466C突变体的构建

2.1 材料与方法

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4讨论

2.5 小结

第3章 野生型MG1655 gyrB466E及突变型gyrB466C对环丙沙星的药物敏感性实验

3.1 材料与方法

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

结论

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢

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