BDNF基因修饰的雪旺细胞促进视神经损伤修复的实验研究

摘要

目的：
　　头面部外伤合并视神经损伤的发病率逐渐上升，伴有视神经损伤的伤者越来越多。由于视神经损伤后难以再生及修复，而且损伤后患者的致残率高，因此视神经损伤患者的正确有效治疗至关重要。目前临床治疗外伤性视神经损伤的主要方法有大剂量激素冲击以及鼻内镜下视神经管减压手术联合激素治疗。但由于受外伤时视神经损伤的程度、伤后手术时机的把握、手术过程中颈内动脉破裂等风险、手术中减压是否彻底、术者的手术经验等各方面的影响，该手术总体有效率并不是太高。一方面，视神经在人类的感官中具有重要的作用，视神经的损伤后，患者的生活质量会受到严重的影响。另一方面，视神经作为中枢神经，损伤后轴突再生及突触重建均较为困难。因此，探索视神经损伤后修复以及再生的研究非常重要。
　　雪旺细胞(SCs)是一种周围神经系统主要的胶质细胞,它包绕轴突并形成髓鞘或者不形成髓鞘，是周围神经系统的鞘细胞。神经损伤后，SCs可返回到早期细胞阶段。SCs逐渐开始分裂、增殖并分泌多种神经营养因子从而创造适宜轴突生长的微环境，同时为神经细胞轴突提供再生的通道。雪旺细胞(SCs)在神经受损后既发挥神经保护的功能，又发挥神经修复的功能。一方面雪旺细胞通过释放多种神经营养因子来改善网膜神经节细胞周围的微环境，减少视网膜神经节细胞的凋亡。另一方面，层粘连蛋白、纤维粘连蛋白和细胞粘合素-C等SCs的细胞外基质能够形成支架，损伤的轴突可以沿着这个通道向靶点延伸，最终完成神经的修复过程。
　　本研究选择大鼠为实验动物，通过手术取得新生大鼠的坐骨神经组织，双酶消化法进行体外培养大鼠坐骨神经SCs。通过基因工程构建携带脑源性神经生长因子(BDNF)基因的腺病毒载体。腺病毒载体体外感染 SCs获得脑源性神经营养因子基因修饰后的雪旺细胞(BDNF-SCs)。在建立大鼠视神经损伤动物模型的基础上，将SCs及BDNF-SCs移植到大鼠玻璃体腔，检测移植前后的F-VEP中P波的潜伏期及波幅值得变化，观察雪旺细胞促进视神经再生的作用，以期寻找一种促进视神经损伤后修复的有效方法。
　　方法：
　　（1）通过手术取得新生大鼠的坐骨神经组织，双酶消化法进行大鼠 SCs的体外分离培养，获得纯度高活性好的体外培养SCs并进行细胞的传代，选取活性好纯度高的SCs进行冷冻保存。
　　（2）通过基因工程构建大鼠携带BDNF基因的腺病毒载体。腺病毒载体构建成功后使用HEK293细胞进行病毒的扩增。
　　（3）使用腺病毒作为载体将BDNF基因转移到大鼠SCs体内获得BDNF-SCs。观察研究SCs及BDNF-SCs的生存情况及活性，并使用ELISA检测其上清液中BDNF的浓度。
　　（4）运用动脉夹夹伤大鼠视神经的方法制作视神经损伤大鼠视神经损伤模型。动物麻醉成功并逐层切开后，找到视神经，用小号动脉夹将眼球后2-3mm处的视神经夹持10秒钟进行视神经损伤。检查大鼠的直接对光反射及间接对光反射。无菌纱布覆盖切口行损伤眼FVEP检测。视神经损伤模型制造成功后，生理盐水冲洗术区，逐层缝合切口。
　　（5）大鼠视神经双眼FVEP检查。动物麻醉后，连接电极，每眼检测3次，记录FVEP的波形图，测量FVEP波形中的P波潜伏期值和波幅值，取其平均值为最终结果。测量方法：潜伏期的测量方法由起始至P波的波峰是为P的潜伏期。振幅值的测量的方法为N1波的波谷至P波的波峰为P波的波幅值。
　　（6）选取健康普通级成年大鼠60只，雌雄不限，体重在250g左右，随机分成3组，分别为损伤视神经组、损伤视神经+SCs移植组，损伤视神经+BDNF-SCs移植组，每组20只大鼠。每只大鼠均损伤左眼，右眼为自身对照。单纯损伤组在动物模型制作成功后玻璃体腔内注射生理盐水作为对照。SCs移植组大鼠动物模型制作成功后玻璃体腔内注射SCs悬液。BDNF-SCs移植组大鼠动物模型制作成功后玻璃体腔内注射BDNF-SCs悬液。分别于移植后3、7、14、28天行闪光视觉诱发电位检查，记录视觉诱发电位中P波的潜伏期值及波幅值。
　　采用SPSS统计软件进行分析。使用方差分析对闪光视觉诱发电位的P波潜伏期值及波幅值进行统计分析。使用 Bonferroni检验进行同一时间条件下组间两两比较。以0.05作为检验标准，P＜0.05时认为差别具有统计学意义。处死大鼠后取损伤视神经进行HE染色及甲苯胺蓝髓鞘染色,光镜下观察视神经形态的变化.
　　结果：
　　（1）培养初期的SCs有的呈椭圆形贴壁生长。培养24小时后正常生长的SCs呈长梭形，细胞核呈圆形，体积较成纤维细胞小，大部分有两个长短不一的突起，细胞交织成网状排列生长，生长于成纤维细胞上层，在显微镜下可见到细胞周围发亮。培养的下层可见成纤维细胞。成纤维细胞形状不规则，有梭形、多角形等，胞体较大，胞核明显。成纤维细胞的胞体边缘无明显折光性，看不到细胞周围发亮。10天后可见SCs与成纤维细胞分层密集生长。SCs下层为成纤维细胞，细胞胞体较大；上层为SCs，其胞膜折光性强，胞体边缘发亮，有的可达到80%融合。成纤维细胞密集生长并未抑制SCs的生长。组织块逐渐变为组织碎屑，相邻组织块之间细胞生长时可逐渐融合。随着培养时间的延长和SCs的不断增殖，细胞浓度逐渐增大。经传代后，镜下见SCs呈典型的长梭形、双极状。腺病毒载体感染SCs后, BDNF-SCs镜下未见有任何细胞形态变化,状态良好。BDNF腺病毒感染后3小时,显微镜下观察SCs未见有任何细胞形态学变化,生长状态良好；病毒感染后24小时以及48小时,镜下观察感染后SCs的生长状态，细胞仍同感染前，呈双极状肩并肩排列生长，长势良好。感染后的SCs普通光镜下与感染前无明显区别，在荧光显微镜下可见细胞内有明显的荧光标记，为携带荧光的BDNF基因进入SCs后所显示出来。
　　（2）普通SCs培养液中可检测到BDNF，但浓度较低，随着细胞培养时间的延长，BDNF的量逐渐增多，培养7天以后BDNF含量增加的速度加快。感染后SCs的培养液中BDNF的含量及增加趋势与感染前相似，但是其培养液上清中BDNF表达量明显增多。培养3天后，BDNF-SCs培养液上清中BDNF含量开始增高，培养后7天、14天的培养液上清中 BDNF表达量明显增高。培养3天时，两组细胞培养液上清中BDNF表达量比较,P＞0.05,没有统计学意义。培养后7天、14天时，BDNF-SCs培养液上清中BDNF含量较SCs培养液上清中明显升高，P＜0.01，有统计学意义。
　　（3）正常大鼠双眼FVEP检查，双眼FVEP波形正常,由一系列比较典型的N1PN2正负波组成，能引出良好的P波，并且P波的出现比较稳定，重复性好，波幅高，潜伏期值和波幅值大致相同。双眼P波潜伏期值差别无统计学意义。双眼P波的波幅值的差别无统计学意义。单纯损伤组:损伤前、损伤后3d、损伤后7d、损伤后14d、损伤后28d的波幅值分别为25.2±4.05,5.1±0.34,5.27±0.48,5.63±0.5,6.36±0.58(μV);损伤前、损伤后3d、损伤后7d、损伤后14d、损伤后28d的潜伏期分别为58.95±6.79,121.1±10.74,108.3±6.53,107.2±8.1,104.65±9.43（ms）。SCs移植组:损伤前、损伤后3d、损伤后7d、损伤后14d、损伤后28d的波幅值分别为25.3±3.37,6.95±1.61,7.8±1.64,7.85±2.08,8.95±1.9;(μV)损伤前、损伤后3d、损伤后7d、损伤后14d、损伤后28d的潜伏期分别为59.3±4.92,87.2±4.49,83.8±3.94,80±3.91,77.55±3.41（ms）。BDNF-SCs移植组:损伤前、损伤后3d、损伤后7d、损伤后14d、损伤后28d的波幅值分别为24.6±4.77,12.45±3.13,65±2.64,14.65±3.03,15.7±3.1(μV);损伤前、损伤后3d、损伤后7d、损伤后14d、损伤后28d的潜伏期分别为62.25±3.34,78.6±5.04,73.7±5.36,71.15±3.73,67.45±3.79（ms）。
　　（4）损伤后相同时间条件下P波潜伏期BDNF-SCs移植组较其他两组缩短，SCs移植组较单纯损伤组缩短（P＜0.05）。损伤后相同时间条件下P波波幅BDNF-SCs移植组较其他两组高，SCs移植组较单纯损伤组高（P＜0.05）。
　　（5）HE染色：垂直于视神经长轴横切片观察，切面均呈椭圆形或圆形，染色比较均匀。视神经损伤后镜下可见到结构紊乱、胶质细胞增生以及空泡样变性。损伤神经的纤维断裂、可有局部出血，有时可见鞘膜与视神经分离。
　　（6）免疫组化染色：甲苯胺蓝正常视神经均匀染色，在横切面上神经髓鞘呈环状蓝染，背景为粉红色。视神经纤维不染色。细胞核呈深蓝色位于细胞一侧。不同程度损伤后的视神经镜下可见不均蓝染，可伴有视神经与髓鞘分离现象。
　　结论：
　　（1）体外培养可获得纯度较高的大鼠SCs。
　　（2）通过基因工程可以构建携带BDNF的腺病毒载体。携带BDNF基因的腺病毒载体可以高效转染体外培养大鼠SCs，并可以获得能够高度表达BDNF蛋白的BDNF-SCs。
　　（3）大鼠SCs移植对视神经损伤修复具有明显的促进作用。
　　（4）和SCs相比，BDNF-SCs能够分泌更多的BDNF，表现出更好的保护视神经功能、促进受损视神经修复的作用。

目录

引言

第一部分 SCs的分离、培养

材料与方法

结果

讨论

第二部分 BDNF基因重组腺病毒载体的构建

材料和方法

结果

讨论

第三部分 重组腺病毒体外转染大鼠SCs的实验研究

材料和方法

结果

讨论

第四部分 大鼠视神经损伤动物模型的建立、BDNF基因饰的SCs对视神经损伤的修复的实验研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述:雪旺细胞与视神经再生

攻读学位期间的研究成果

附图

致谢

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