南极冰藻CPD光修复酶基因的真核表达及其紫外线辐射损伤修复功能研究

摘要

南北极巨大臭氧空洞的出现，使得到达地表的紫外线辐射增强，对人类健康和自然生态环境造成严重影响。紫外线辐射主要损害是在 DNA中形成嘧啶二聚体（CPDs）和6-4光产物（6-4）PPs，它们阻碍了DNA的复制或转录，导致DNA的紫外辐射损伤，具有致突变、致癌变和致死等效应。DNA光修复酶承担修复 DNA损伤并保持生物遗传稳定性的重要功能，根据其作用底物的不同可以分为CPD光修复酶和（6-4）光修复酶；这两种酶的作用机理相似，但一种酶只能修复一种损伤而不能修复另外一种。由于紫外线辐射产生的 CPDs和（6-4）PPs分别为80-90%和10-20%，目前对光修复酶的研究多集中在CPD光修复酶。哺乳动物（包括人类）缺少光修复系统，已有研究表明低等生物的光修复酶对人体的 DNA修复同样有效。南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L能在强紫外辐射环境中生存，其DNA光修复酶应具有较强的生物活性。本文主要开展南极冰藻CPD光修复酶基因的真核表达及其紫外线辐射损伤修复功能研究，以期为南极冰藻光修复酶应用于紫外线损伤修复及其相关疾病防治提供可靠科学依据。
　　目的：
　　通过本研究，认识南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L在UV-B辐射条件下的生长特性，构建南极冰藻CPD光修复酶的真核表达体系，进行高效表达，并分离纯化南极冰藻 CPD光修复酶，研究其体内和体外生物学活性；同时探索南极冰藻 CPD光修复酶活性中心位点的功能，在细胞和动物体水平研究南极冰藻CPD光修复酶对紫外线辐射损伤的修复功能。
　　方法：
　　1.利用分光光度计测定南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L在UV-B辐射条件下的生长曲线，并测定其活性氧自由基的产生速率和丙二醛含量；同时分别采用邻苯三酚自氧化法、愈伤木酚法和分光光度法测定南极冰藻超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性。
　　2.利用PCR克隆南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修复酶全长基因，进行测序验证；然后构建真核表达载体，转化、筛选阳性克隆，并进行PCR检测，获得南极冰藻CPD光修复酶基因酵母工程菌。
　　3.利用单因素实验优化南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修复酶基因酵母工程菌的培养条件，诱导表达融合蛋白，利用镍柱亲和层析进行分离纯化；利用SDS-PAGE和Western blot对纯化蛋白进行检测，并对纯化蛋白进行N’端测序验证。
　　4.通过计算南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修复酶基因酵母工程菌在紫外辐射环境中的存活率，检测其耐紫外辐射功能，明确体内修复活性；利用紫外吸收光谱法，体外检测纯化的南极冰藻CPD光修复酶修复嘧啶二聚体的活性。
　　5.利用点突变研究了南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修复酶活性中心位点271R（精氨酸），323E（谷氨酸）和395M（甲硫氨酸）的功能；271R（精氨酸Arg）突变为G（甘氨酸Gly），标记为R271G；323E（谷氨酸Glu）突变为A（丙氨酸Ala），标记为E323A；395M（甲硫氨酸Met）突变为I（异亮氨酸Ile），标记为M395I。
　　6.实验分别设置对照组、紫外照射组、南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修复酶预防组和治疗组；利用细胞计数和 Transwell分别检测人角膜上皮细胞系（HCEC）细胞的增殖和迁移作用；分别构建小鼠角膜上皮损伤模型和小鼠皮肤紫外损伤模型，研究南极冰藻CPD光修复酶的紫外辐射损伤修复功能。
　　结果：
　　1.紫外线辐射对南极冰藻的生长具有抑制作用。在UV-B辐射条件下，南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L的生长速度低于无紫外线辐射对照组的生长速度；当紫外辐射强度达到100μW·cm-2时，南极冰藻细胞密度逐渐降低，并完全消亡。在UV-B辐射环境的胁迫下，在较短时间内南极冰藻细胞会产生大量的活性氧自由基，并导致南极冰藻中丙二醛含量的迅速提高；南极冰藻体内的抗氧化酶体系对UV-B辐射进行快速的应激反应，提高抗氧化酶活性，消除活性氧自由基，使得UV-B辐射与体内活性氧逐渐产消平衡，从而保护冰藻细胞不致受到伤害。
　　2.从南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L中成功克隆获得CPD光修复的全长基因，并将其在酿酒酵母中表达，成功构建南极冰藻CPD光修复酶重组酿酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae-SCPD。
　　3.南极冰藻CPD光修复酶重组酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae-SCPD生长0-2 h为迟缓期，2-10 h进入对数生长期，到10 h后进入稳定生长期，在24 h时仍保持较高的生物量；表达CPD光修复酶最适培养条件为温度为20℃，pH值为7.0，NaCl浓度为1%，半乳糖浓度为0.5 mmol/L。分离纯化了重组南极冰藻CPD光修复酶，其浓度为0.25 mg/mL；其N端序列为NH2-Pro-Lys-Arg-Thr-Gln（PKRTQ），与南极冰藻CPD光修复酶理论N端氨基酸序列一致。
　　4.在未照射UV-B条件下，转南极冰藻CPD光修复酶基因酿酒酵母S.cerevisiae-SCPD和转空白载体酿酒酵母S.cerevisiae-NULL的存活率基本一致；在照射UV-B条件下，S.cerevisiae-SCPD的存活量显著高于S.cerevisiae-NULL的存活量。寡链嘧啶核苷酸d(pT)16经100μW/cm2 UV-B照射后，其A265值在照射1 h内急剧降低，在照射时间达到3 h后其A265达到恒定，表明寡链嘧啶核苷酸d(pT)16经UV-B辐射形成嘧啶二聚体；然后加入南极冰藻CPD光修复酶后，A265值在20 min快速升高，在其后修复能力达到极限，在20-50 min，对嘧啶二聚体的修复没有明显升高。
　　5.南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修复酶中R271（精氨酸）应为FAD结合位点的组成氨基酸，R271G点突变的Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修复酶活性降低；南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修复酶中E323（谷氨酸Glu）属于隐花色素蛋白组成氨基酸，且位于蛋白α螺旋结构中，E323A点突变的Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修复酶活性降低；M395（甲硫氨酸Met）位于南极冰藻CPD最大的α螺旋结构中，该螺旋结构与DNA的结合位点有关，M395I点突变的南极冰藻CPD光修复酶基本上失去活性。
　　6.与对照组相比紫外线照射组HCEC细胞的数量明显减少，与紫外照射组相比，南极冰藻CPD光修复酶预防组和治疗组的HCEC细胞的数量明显增加，且预防组与治疗组HCEC细胞的数量无明显变化；对照组相比，紫外线照射组HCEC细胞的迁移明显减少，与紫外照射组相比，南极冰藻CPD光修复酶预防组和治疗组的HCEC细胞的迁移明显增加，且预防组和治疗组HCEC细胞的迁移无明显变化。与对照组相比，紫外线照射组小鼠角膜上皮缺损面积变大，与紫外线照射组相比，南极冰藻CPD光修复酶预防组和治疗组的小鼠角膜上皮缺损面积变小，且预防组相比和治疗组小鼠角膜上皮缺损面积差异不大。对照组小鼠皮肤光滑，红润，无皱褶；组织切片显示皮肤表皮较薄，基底层细胞呈矮立方形，只有1-2层棘层细胞，颗粒层不明显。紫外组小鼠皮肤粗糙，破损，有出血点；与对照组相比，紫外照射组小鼠皮肤表皮明显变厚，细胞层数增加，其中基底层细胞呈高柱状、排列紧密、可见大量核分裂相，棘层细胞约有5-6层，其外可见2-3层颗粒层细胞，胞质内充满大量嗜碱性透明角质颗粒，角质层较对照组亦增厚。南极冰藻CPD光修复酶治疗组小鼠皮肤略粗糙，基本无破损；组织切片显示，与紫外照射组相比，表皮厚度明显薄，细胞层数减少，基底层细胞呈立方形，排列整齐，极性好，核分裂像较照射组少见。
　　结论:
　　1.南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L对紫外辐射的适应能力较强，但紫外线辐射对南极冰藻的生长具有抑制作用，其抗氧化酶系统在南极冰藻适应南极强辐射环境中起着重要的作用。
　　2.构建了南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修复酶基因的真核表达体系，使其在酿酒酵母中表达，获得南极冰藻CPD光修复酶重组酿酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae-SCPD，成功分离纯化南极冰藻CPD光修复酶，并用N端测序加以验证。
　　3.南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修复酶具有较强的体内和体外活性，能提高重组酿酒酵母在UV-B辐射环境的存活率，在体外可快速修复嘧啶二聚体。
　　4.南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修复酶点突变对其活性影响较大；R271G突变可能对电子传递功能产生影响，E323A突变可能对蛋白结构产生影响，M395I突变对酶与DNA的结合影响较大。
　　5.紫外照射抑制HECE细胞的增殖和迁移能力，而外源性南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修复酶可促进细胞的增殖能和迁移能力。紫外照射抑制小鼠角膜上皮细胞的损伤修复，而外源性南极冰藻CPD光修复酶可促进小鼠角膜上皮的损伤修复速度。小鼠机体为拮抗紫外线对皮肤的辐射作用，刺激基底细胞不断增殖分裂、迁移、分化为角质细胞，使得皮肤增厚，本实验制备的南极冰藻CPD光修复酶能缓解小鼠皮肤的紫外辐射损伤。