siRNA干扰Slug基因表达对IEC-6细胞放射线敏感性影响

摘要

目的：通过研究siRNA干扰Slug基因表达对体外肠隐窝细胞IEC-6接受X线照射的敏感性影响及机制，探讨 Slug基因对肠道干细胞的保护作用，为减轻正常肠道组织的辐射损伤寻求新的策略。
　　方法：（1）以体外培养的大鼠小肠隐窝上皮细胞 IEC-6为研究对象，针对已知的Slug基因的cDNA序列，设计并合成3条特异性序列（siRNA-Slug-1、siRNA-Slug-2、siRNA-Slug-3）和1条非特异性序列（siRNA-NC）。（2）利用锐博生物公司提供的转染技术对 IEC-6细胞进行瞬时转染。将细胞分为三组，分别为：实验组，阴性对照组和空白对照组。实验组细胞转染 siRNA-Slug小干扰RNA，阴性对照组转染siRNA Negative Control（siRNA-NC），空白对照组不转染任何小干扰RNA。（3）在荧光显微镜下观察细胞的转染效率，选择最佳转染浓度和转染时间进行后续实验。（4）采用Western blot法检测各组细胞Slug基因被干扰后在蛋白水平的表达变化，以及Slug基因被沉默的同时PUMA蛋白水平的表达变化。（5）通过CCK8实验检测沉默Slug基因联合放疗对IEC-6细胞增殖情况的影响。（6）流式细胞仪（FCM）检测各组细胞的凋亡率。（7）克隆形成实验观察 IEC-6细胞的放射敏感性。（8）采用SPSS21.0和GraphPad Prism5软件进行统计分析，计量资料结果以?χ± S形式表示，数据间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　结果：（1）利用锐博生物公司提供的转染技术能够成功将siRNA-Slug瞬时转染入IEC-6细胞。（2）利用Western blot成功筛选出干扰效果最好的siRNA-Slug。同时Western blot结果显示：经X线照射，实验组细胞内的Slug蛋白表达与阴性对照组和空白对照组相比明显降低（P＜0.01）；实验组细胞的 PUMA蛋白表达明显高于阴性对照组和空白对照组（P＜0.01），且随着实验组细胞内的Slug蛋白表达的下调，PUMA的蛋白表达增高。（3）CCK8结果显示在0~6Gy剂量范围内，随着X线剂量的增加，细胞的增殖活性降低；在6Gy剂量下，实验组与阴性对照组和空白对照组比较，生长抑制率明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。（4）流式细胞术显示经X射线照射后，与阴性对照组和空白对照组相比，实验组细胞的凋亡率增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。（5）细胞克隆形成实验表明，实验组细胞的存活分数明显低于阴性对照组和空白对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。
　　结论： siRNA干扰Slug基因表达能够增强 IEC-6细胞对X射线的敏感性，其机制是通过诱导PUMA表达上调实现的。

目录

引言

材料与方法

1.1 实验细胞

1.2 实验试剂

1.3 主要实验仪器

1.4 siRNA-Slug序列

1.5 实验试剂的配制

2 细胞培养

2.1 细胞传代

2.2 细胞冻存

2.3 细胞复苏

2.4 细胞计数

3 细胞转染

3.1 siRNA-Slug瞬时转染大鼠小肠隐窝IEC-6细胞

3.2 转染浓度的筛选

3.3 观察转染效率

4 实验分组及细胞照射

5 Western Blot 法检测Slug和PUMA蛋白的表达

5.1 细胞蛋白的提取

5.2 SDS-PAGE蛋白电泳

5.3 转膜

5.4 封闭、抗体杂交

5.5 ECL化学发光、显影

6 CCK8法检测沉默Slug基因联合放射线对细胞增殖的影响

7 流式细胞术检测IEC-6细胞的凋亡率

8 细胞克隆形成实验检测沉默Slug基因对放射敏感性的影响

9 统计学分析

结果

1 IEC-6细胞转染效率的检测

2 Western blot筛选干扰结果

3 Western blot检测IEC-6细胞Slug和PUMA蛋白表达

4 CCK8检测沉默Slug基因联合放射线对IEC-6细胞增殖的影响

5 流式细胞术检测IEC-6细胞凋亡情况

6 克隆形成实验检测沉默Slug基因后放射敏感性

讨论

结论

参考文献

综述：Slug：与肿瘤的侵袭和转移密切相关的基因

攻读学位期间的研究成果

缩略词表

致谢

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