NDRGl通过抑制滋养细胞侵袭参与子痫前期发病机制的探讨

摘要

子痫前期（Preeclampsia, PE），是妊娠期高血压疾病(hypertensive disorders complicating pregnancy, HDCP)的特殊类型，主要特征为：妊娠20周以后出现高血压、蛋白尿和水肿，而分娩后血压恢复正常。由于地理、社会、经济和种族、文化等的差异，不同地区发病率不同。世界范围内，子痫前期发病率约为2%-8%，而我国子痫前期发病率偏高，约为9.4%。尽管越来越多的国家在不断改善母婴的健康，但每年死于妊娠相关性疾病的女性超过50万，大约10%～15%的孕产妇直接死于子痫前期和子痫。
　　子痫前期的病因及发病机理至今尚未完全阐明，目前普遍认为，滋养细胞在子宫螺旋动脉侵入过浅和受限是子痫前期发病的关键环节。滋养细胞是构成胎盘结构的主要成分，对于胎盘形成及维持胎儿正常发育起着重要作用。在囊胚植入早期，滋养外胚层细胞即分化为两类滋养层细胞，即细胞滋养层细胞和合体滋养层细胞，前者又有两种分化途径：与合体滋养层细胞融合或分化为绒毛外滋养层细胞。绒毛外滋养层细胞具有侵袭能力，一部分绒毛外滋养层细胞侵润至子宫内膜的深层、直至子宫肌层的内三分之一，称为间质滋养层细胞；一部分绒毛外滋养层细胞侵入母体子宫螺旋动脉，称为血管内滋养层细胞，并逐步取代血管内皮及血管平滑肌细胞，引起血管基底膜降解，重塑螺旋动脉(spiral artery，SPA)，形成高流、低阻SPA，以提供胎儿胎盘充足的血流量。胎盘形成过程中滋养细胞侵袭发生障碍，SPA侵入过浅，胎盘血流减少，一方面可引起胎儿宫内生长受限，另一方面滋养细胞将分泌某些细胞因子或激素，导致全身血管内皮功能损伤和炎症反应过度，引起高血压、蛋白尿等一系列临床症状，从而诱发子痫前期。滋养细胞与肿瘤细胞的浸润过程相似，不同的是滋养细胞的侵袭受到精细调控，此过程涉及复杂的细胞信号转导通路，但具体的分子机制尚未被完全阐明。
　　N-myc下游调节基因1(N-myc downstream regulatedgene1，NDRG1)，又称为分化相关基因1(differentiation related gene I,DRGl)、应激诱导应答42(response induced by stress42，Rit42)、氧调节蛋白1(protein regulated by oxygen-1，PROXYl)基因等，1997年在结肠癌细胞株中首次发现。NDRG1是一组进化过程中相对保守序列，可在多种组织中表达，参与细胞增殖、分化、缺氧及应激反应等多种生理功能的调节。近年来发现NDRG1分子在肿瘤浸润过程中发挥重要作用，可下调基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)表达，抑制人类多种肿瘤（前列腺癌、直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌）细胞的转移。体内、外实验研究表明NDRG1过表达可抑制肿瘤细胞的侵袭和转移能力，而滋养细胞的侵蚀行为类似于肿瘤细胞。研究证实，在胎盘组织中NDRG1主要表达于滋养细胞，且子痫前期患者胎盘组织中NDRG1表达明显升高，这提示NDRG1可能参与了子痫前期的发生发展。子痫前期根据发病时间可分为早发型子痫前期和晚发型子痫前期，一般发病越早，病情越严重。NDRG1在早发型子痫前期和晚发型痫前期是否存在差异性表达？目前尚未见报道。
　　滋养细胞侵袭异常与螺旋动脉重塑障碍引起胎盘灌注减少、缺血缺氧，这是子痫前期最重要的发病机制之一，而NDRG1表达可以抑制肿瘤细胞的侵袭，因此NDRG1可能调控滋养细胞的侵袭过程，因此本研究通过体外实验沉默滋养细胞系JEG-3中NDRG1的表达，探讨细胞侵袭能力的变化。
　　众所周知，细胞侵袭的过程实际上是蛋白酶对组织的水解作用过程，基质金属蛋白酶是一类锌依赖性蛋白水解酶，经激活可降解大多数细胞外基质成分。研究表明，子痫前期时子宫螺旋动脉重塑过程与基质金属蛋白酶表达密切相关，其中MMP-2、MMP-9是滋养细胞侵袭过程中的限速酶。细胞外调节蛋白激酶（ERK）是丝裂原活化蛋白激酶MAPK家族中的一员，其异常激活与恶性肿瘤的侵袭、转移密切相关，且可上调MMP-9表达，该信号通路是否参与NDRG1的调控作用目前尚未见报道。因此，本实验通过沉默滋养细胞系JEG-3中NDRG1的表达，探讨NDRG1调控滋养细胞侵袭的分子机制。
　　实验目的：
　　本研究首先通过检测早发型子痫前期及晚发型子痫前期患者胎盘组织中NDRG1的表达变化与定位，进一步验证NDRG1与子痫前期发生发展密切相关。而后通过基因沉默技术抑制滋养细胞NDRG1表达后观察细胞活性、侵袭能力的改变及ERK/MMP信号通路相关蛋白表达的变化，以明确NDRG1对滋养细胞侵袭性的影响及在子痫前期中的作用，并探讨其作用机制，为阐明子痫前期的分子机制提供线索。
　　实验方法：
　　1. NDRG1在子痫前期患者胎盘中的表达（此部分内容发表在PLACENTA杂志）
　　选择2014年9月到2015年3月在青岛大学医学院附属医院妇产科定期检查并住院分娩的子痫前期患者40例为实验组，其中早发型子痫前期患者和晚发型子痫前期患者各20例；选择该院同期的健康、单胎足月妊娠孕妇20例为对照组；选择同期门诊因意外妊娠、非医学原因进行流产的患者20例为早孕组；孕周不足37周而无其他并发症的20例孕妇为早产组。
　　收集临床资料（妊娠次数、孕周、蛋白尿、血压、新生儿体重等），并于胎盘娩出后，选取胎盘胎儿面、脐带根部周围组织冻存，人工流产患者，收集其早孕绒毛组织冻存。采用免疫组织化学、实时荧光定量PCR（Real time PCR, RT-PCR）和组织蛋白印迹(Western Blot)分析技术，对比NDRG1在各组患者胎盘组织中的表达及定位。
　　2.沉默NDRG1表达对JEG-3细胞侵袭的影响
　　常规培养人绒毛膜癌滋养细胞系JEG-3细胞，实验分为两组：对照组与siRNA组（NDRG1基因沉默），siRNA组通过基因沉默技术抑制NDRG1表达。采用MTT实验及流式分析技术分别检测两组细胞的增殖及凋亡的变化，采用Transwell实验方法检测细胞的侵袭能力。
　　3. NDRG1表达影响JEG-3细胞侵袭的分子机制
　　将人绒毛膜癌滋养细胞系JEG-3细胞分为两组：对照组和siRNA组（NDRG1基因沉默），收集上述两组细胞的培养液上清，采用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）方法分析滋养细胞MMP-2和MMP-9分泌量的变化；分别提取两组细胞蛋白，通过Western Blot方法检测细胞中ERK、p-ERK、MMP-2和MMP-9表达水平的变化。
　　实验结果：
　　1.一般临床资料
　　本实验中对照组、早孕流产、早产、早发型子痫前期、晚发型子痫前期各组参与者在妊娠次数上无统计学差异。所有子痫前期患者均有高血压和蛋白尿，早发型子痫前期组和晚发型子痫前期组收缩压分别增加26%和40%，舒张压分别增加了52%和39%。与对照组相比，早发型子痫前期组患者孕周缩短了14%(P＜0.05)，均早产；早发型子痫前期组和晚发型子痫前期组新生儿体重分别减少54%和41%，且早发型子痫前期组的新生儿平均体重低于晚发型子痫前期组(P＜0.01)。
　　2.胎盘组织中NDRG1表达结果
　　患者胎盘组织免疫组织化学分析结果显示：NDRG1表达于细胞滋养层细胞、合体滋养层细胞，在细胞间质，细胞膜和细胞质均有着色。与足月妊娠组（对照组）相比，早孕流产组NDRG1表达水平较低（P＜0.05)，而早产组表达水平升高（P＜0.01)，早发型子痫前期组与晚发型子痫前期组NDRG1表达增多更甚，且早发型子痫前期组高于晚发型子痫前期组（P＜0.01)，差异具有统计学意义。RT-PCR及Western Blot分析结果与免疫组化结果一致。值得注意的是早发型子痫前期组NDRG1 mRNA及蛋白表达水平较同孕周早产组明显升高，晚发型子痫组NDRG1 mRNA及蛋白表达水平较同孕周足月妊娠组也显著增高。
　　3.NDRG1表达对JEG-3细胞侵袭能力的影响
　　siRNA转染72小时后，JEG-3细胞的NDRG1被沉默，其蛋白表达水平降低了91.14%，提示基因沉默成功。与正常对照组相比，siRNA组细胞增殖活性及凋亡比例无明显变化。然而Transwell实验结果显示：NDRG1基因沉默后，穿过Matrigel迁移至滤膜下的细胞数量明显增多（P＜0.01)。
　　4.NDRG1对JEG-3细胞中ERK/MMPs表达的影响
　　ELISA检测siRNA细胞培养上清中MMP-2和MMP-9的表达，结果发现：与对照组相比，siRNA组细胞上清中MMP-2表达增加了101.2%，MMP-9表达增加了65.01%，对比具有显著差异。
　　Western Blot结果显示：NDRG1基因沉默使JEG-3细胞MMP-2的相对表达量增加了53.7%，MMP-9的相对表达量增加了48.83%。ERK1和ERK2总表达水平与正常对照无统计学差异，但p-ERK1和p-ERK2总蛋白水平较对照组增加了61%，差异显著。
　　实验结论：
　　1.NDRG1在妊娠早期表达水平较低，随妊娠时间增加，表达水平增加。
　　2.在子痫前期的胎盘组织中，尤其是早发型子痫前期，NDRG1表达水平显著增加。
　　3.沉默NDRG1的表达，增强了JEG-3细胞的侵袭能力。
　　4.NDRG1通过ERK/MMP-2/9信号通路影响滋养细胞的侵袭，可能是人类子痫前期发生的分子调控机制之一。

目录

引言

一、子痫前期的由来及分类

二、子痫前期导致围产期母婴死亡率增加

三、子痫前期的长期并发症

四、子痫前期的发病机制

五、N-myc下游调节基因与子痫前期

第一部分 NDRG1在子痫前期胎盘中的表达

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 沉默NDRG1对滋养细胞侵袭的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 NDRG1影响JEG-3细胞侵袭的分子机制

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述:N-myc下游调节基因1参与疾病的分子机制研究进展

攻读学位期间的研究成果

缩略词表（附录）

致谢

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