人参皂苷Rg1抑制原代中脑星形胶质细胞炎症反应的机制探讨

摘要

星形胶质细胞作为中枢神经系统中数量最多、体积最大的胶质细胞，不仅是构成中枢神经系统的基本骨架，而且是其正常功能的重要参与者。大量研究显示星形胶质细胞参与了神经退行性疾病，如帕金森病（Parkinson's Disease, PD）的病理过程。激活的星形胶质细胞能够释放一系列的炎症因子、活性氧和活性氮等，从而发挥其神经损伤作用。
　　人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）是传统中药人参的主要活性成分，离体细胞和整体动物实验均证实Rg1具有抗炎作用，但是Rg1通过何种机制作用于星形胶质细胞发挥抗炎作用，目前尚不清楚。Rg1具有甾体结构骨架，本课题组前期研究结果证实Rg1具有类雌激素样和类糖皮质激素样作用，可以作为糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor, GR）的功能性配体，对抗神经毒素对神经元的损伤。GR是转录因子核激素受体超家族中的一员，通过与糖皮质激素结合控制多个细胞事件。有研究显示，GR参与星形胶质细胞反应性损伤及神经胶质瘤的发展。G蛋白偶联雌激素受体（G protein-coupled estrogen receptor, GPER）是一种新型的膜性雌激素受体，雌激素可以通过GPER介导的快速非基因组机制，发挥抗炎和抗凋亡等作用。本课题组前期的工作证实Rg1是一种新的植物雌激素，可通过非配体依赖的方式激活雌激素受体（estrogen receptor, ER），那么Rg1能否通过GR和GPER抑制星形胶质细胞的炎症反应？目前研究较少。本研究在脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）制备的大鼠原代培养的星形胶质细胞炎症模型上，采用MTT、免疫细胞荧光、real time PCR和western blot技术方法，应用GR的特异性阻断剂RU486或GPER的特异性阻断剂G15与Rg1共同作用，探讨Rg1的抗炎作用及其分子机制。此外，本研究应用Rg1单独作用星形胶质细胞，探讨了其对星形胶质细胞活化的影响及其分子机制。实验结果如下：
　　1.人参皂苷Rg1抑制LPS诱导的星形胶质细胞炎症反应的实验研究
　　（1）原代培养中脑星形胶质细胞，应用免疫细胞化学的方法，检测星形胶质细胞特异性标记物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）的表达，结果显示95%以上为星形胶质细胞。
　　（2）单用LPS（1μg/mL）或不同浓度Rg1（0.1,1,10和20μM）处理星形胶质细胞24h，MTT结果显示，其对星形胶质细胞增殖没有影响（P＞0.05）。
　　（3）LPS能明显增加星形胶质细胞TNFα、IL-1β和iNOS mRNA的表达（P＜0.001）， 不同浓度Rg1（0.1,1,10和20μM）能够剂量依赖式的抑制LPS诱导的炎症反应，其中20μM Rg1作用最明显（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），我们选用20μM的Rg1进行后续试验。
　　（4）GR阻断剂RU486（1μM）不能阻断Rg1对LPS诱导的TNFα、IL-1β、COX2和iNOS mRNA表达的抑制作用（P＞0.05）。
　　（5）RU486能够阻断Rg1对LPS诱导的炎症因子限速酶COX2和iNOS蛋白表达的抑制作用（P＜0.01，P＜0.001）。
　　（6）GPER阻断剂G15（1μM）能够阻断Rg1对LPS诱导的TNFα、IL-1β、COX2和iNOS mRNA表达的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。
　　（7）GPER特异性激动剂G1（1μM）能够明显抑制LPS诱导的TNFα、IL-1β、COX2和iNOS mRNA的表达（P＜0.01, P＜0.001）。 G15不能阻断G1在mRNA水平对TNFα、IL-1β和COX2表达的抑制的作用（P＞0.05），但可以阻断iNOS的基因表达（P＜0.05）。
　　（8）G15能够阻断Rg1和G1对LPS诱导的COX2和iNOS的蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01）。
　　2.人参皂苷Rg1促进星形胶质细胞活化的实验研究
　　（1）Rg1单独作用星形胶质细胞6,12,24和48h，可以时间依赖性调控GFAP、GDNF及c-fos mRNA的表达（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。
　　（2）应用GPER阻断剂G15，可以阻断Rg1在不同时间点对GFAP、GDNF及c-fos mRNA表达的调控（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。
　　（3）Rg1单独作用星形胶质细胞30min，可以明显增加ERK、CREB蛋白的磷酸化水平（P＜0.05），此作用可以被G15所阻断（P＜0.05）。
　　结论：上述实验结果表明，人参皂苷Rg1能够抑制LPS诱导的星形胶质细胞炎症反应，其作用机制可能与GPER信号通路有关。GR信号途径部分参与了Rg1的抗炎作用。单独应用Rg1能够促进星形胶质细胞的活化，此作用可能与GPER介导的腺苷酸环化酶和MAPKs信号通路的激活有关。

目录

引言

材料与方法

1 实验动物准备

2实验试剂

3实验仪器

4原代大鼠星形胶质细胞的培养

5免疫细胞荧光

6 MTT法

7实时荧光定量反转录PCR

8免疫印迹实验

9统计学分析

结果

1人参皂苷Rg1抑制LPS诱导的星形胶质细胞炎症反应的实验研究

2人参皂苷Rg1促进星形胶质细胞增殖和活化的实验研究

讨论

结论

参考文献

综述:神经炎症在PD中的作用及人参皂苷的防治研究进展

攻读学位期间发表的论文、参加的会议和参与的课题情况

附录

致谢

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