HIPPO-YAP通路及miRNA-186在胰腺癌中的表达及意义

摘要

目的：胰腺癌发病率近年在我国逐年上升,分别占我国恶性肿瘤发病率和死亡率的第7位和第6位,占美国的第8位和第4位。胰腺癌诊断困难，预后差，且容易复发，已成为影响人类健康的重要疾病之一。目前国内外对于生物治疗前景不断在开阔，所以对于阐明胰腺癌的发病机制变得尤为重要。已有较多研究来探讨胰腺癌发生的生物学特点以及各种通路对胰腺癌的调控。HIPPO通路是近年来研究较多的一个通路，实验证实HIPPO通路对于各种肿瘤的发生发展具有调控作用，不同的肿瘤，其调控的作用机制是不同的。我们课题小组在之前的研究中已经探讨过HIPPO通路在胃癌、结肠癌中的调控作用，而此通路中的各个因子对于胰腺癌的发生、发展以及转移的作用还未完全明确。为了进一步明确HIPPO通路中各个因子在胰腺癌发生发展中的调控机制，本研究将探讨HIPPO通路中关键因子YAP、STE-20 like kinase1(MST1)、large tumor suppressor(LATS1），TEAD家族转录因子1（TEAD1)及细胞周期蛋白E(Cyclin E)在正常胰腺组织细胞和胰腺癌组织细胞中的表达，并探讨此通路中各因子的相互作用机制。 对于miRNA与肿瘤的关系，目前成为一个研究热点。目前国内外研究发现其能调控肿瘤的发生、发展。而对于其与胰腺癌的关系研究较少。为了探讨其与胰腺癌发生的关系，本文进一步探讨miRNA-186在胰腺癌患者肿瘤组织和血液中表达情况，探索其对人类胰腺癌的调控机制。 方法：1.收集青岛大学附属医院和青岛市立医院肝胆胰外科2012年至2014年胰腺癌手术切除标本31例，病理报告证实均为原发性胰腺导管腺癌，在术前均未进行化疗和放疗，其中男性17例，女性14例；年龄36-79岁，平均年龄57±0.5岁；其中胰头21例，胰体尾部10例；组织学分型：低分化腺癌17例，中分化腺癌8例，高分化腺癌6例。同时取相应的癌旁组织31例。因外伤原因切除的正常胰腺组织12例，其中男性7例，女性5例；年龄43-76岁，平均年龄59±0.5岁。运用qRT-PCR技术(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和通过Western Blot技术（western blot，WB）方法检测31例胰腺癌患者及其对应的癌旁组织31例，由于外伤所切除的正常胰腺组织12例作为对照组，检测HIPPO-YAP通路中各个因子的表达情况。 2.选取2012年1月-2015年12月青岛大学附属医院和青岛市立医院肝胆胰外科确诊并手术的胰腺癌患者46例，以癌旁组织和同期体检健康志愿者（46人）的血液为对照组。胰腺癌患者组中男性26例，女性20例；年龄40～76岁，中位年龄61岁。对照组男性26例，女性20例；年龄45～75岁，中位年龄58岁。其中胰腺癌患者胰头28例，胰体尾部18例。组织学分型：低分化腺癌22例，中分化腺癌14例，高分化腺癌10例。TNM分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期20例，Ⅲ期4例。其中淋巴结转移26例。以上所有胰腺癌患者均为首次发病，无激素、中药、放化疗等病史，由两院病理学教授明确诊断。以上患者均经过两院伦理委员会同意，并且已经签署知情同意书。运用qRT-PCR技术和Elisa技术检测两种标本中YAP1的mRNA和蛋白表达变化；生物信息学预测miRNA-186的靶基因为YAP1，检测两种标本中miRNA-186的表达变化；通过双荧光素酶报告实验验证miRNA-186是否直接结合YAP1 mRNA；体外培养HPAC人胰腺癌细胞，转染 agomiR-186上调HPAC中miRNA-186表达，通过MTT检测HPAC增殖变化；通过Western Blot技术检测细胞中YAP1 mRNA和蛋白表达变化；siRNA沉默YAP1表达，通过MTT研究YAP1低表达对HPAC细胞增殖的影响。 结果:在胰腺癌组织中MST1和LATS1的mRNA的表达水平低于在正常胰腺组织的表达(P<0.01)。相反，YAP、Cyclin E和TEAD1在胰腺癌组织中表达水平要高于正常胰腺组织(P<0.01)。其中MST1和LATS1mRNA的表达水平从胰腺癌组织到癌旁组织呈上升趋势，YAP、Cyclin E和TEAD1的表达水平从胰腺癌到癌旁组织呈下降趋势。YAP1在胰腺癌患者肿瘤组织和血液中mRNA和蛋白显著上调，相对的miRNA-186在两类标本中表达显著下调（P＜0.05）；细胞实验中，上调miRNA-186表达后YAP1的mRNA和蛋白表达显著降低，减慢HPAC细胞增殖；双荧光素酶报告显示miRNA-186与YAP1的3’-UTR结合，调控其表达；siRNA沉默YAP1后， HPAC细胞同样增殖减慢。 结论:1.胰腺癌组织中MST1和LATS1的表达降低。 2.胰腺癌组织中YAP、CyclinE和TEAD1表达增加。 3.HIPPO-YAP通路与胰腺癌的发生发展有关。 4.胰腺癌患者胰腺癌组织和血液中的YAP1因子表达明显上调。 5.YAP1因子表达上调可能与miRNA-186表达下调有关。 6.miRNA-186可能通过YAP1调控胰腺癌肿瘤细胞的增殖和相关蛋白表达，影响胰腺癌的发生发展。

目录

第一章HIPPO-YAP通路中MST1、LATS1、YAP、CyclinE及TEAD1在胰腺癌中的表达

1引言

2材料和方法

3 统计学分析

4 实验结果

5 讨论

6 结论

参考文献

第二章 miRNA-186对胰腺癌的调控机制研究及临床意义

1引言

2资料与方法

3.统计学分析

4.实验结果

5 讨论

6 结论

参考文献

综述一：Hippo信号通路在胰腺肿瘤研究中的新进展

1.YAP

2.MST

3.LAT

4.TEAD

5.CyclinE

6.总结

参考文献

综述二：MicroRNA对胰腺癌调控机制的研究进展

1.MicroRNA

2.microRNA与胰腺癌

3.miRNA-186

4.miRNA-186与胰腺癌

5.总结

参考文献

攻读学位期间的研究成果

附录

缩略词表

致谢

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