Prrx1诱导上皮-间质转化促进乳腺癌细胞对多西他赛耐药的研究

摘要

【目的】：探讨同源异型核基因1(Prrx1)诱导上皮-间质转化(EMT)促进乳腺癌细胞对多西他赛(Docetaxel)耐药的影响。
　　【方法】：1.用Real-time PCR方法从MCF-7、BT-549和MDA-MB-468三种乳腺癌细胞中筛选出Prrx1低表达乳腺癌细胞株。
　　2.用定制的慢病毒载体感染筛选出的Prrx1低表达乳腺癌细胞株，Real-time PCR验证感染成功后，分别于荧光显微镜的白光和荧光下观察各组细胞形态变化。运用Real-time PCR检测波形蛋白与E-钙黏蛋白的表达。
　　3.用Transwell法检测Prrx1过表达对MCF-7细胞迁移能力的影响。
　　4.CCK-8检测MCF-7细胞的IC50，并检测 Docetaxel作用于实验组、空白对照组和阴性对照组24h后的IC50。
　　5运用流式细胞术检测Docetaxel作用于三组细胞24h后，Prrx1过表达对乳腺癌MCF-7细胞凋亡率的影响。
　　6. Western blot检测三组细胞多药耐药相关蛋白1(ABCB1/p-gp)和Twist1的表达。
　　【结果】：三种细胞中，Prrx1相对表达量最低的是MCF-7细胞(p＜0.001)。用Prrx1过表达慢病毒感染MCF-7细胞后，细胞形态由“铺路石样”变成长梭形，并且荧光效率高达80%以上。Real-time PCR结果显示Prrx1mRNA相对表达量是转染前252.09倍(t=44.30, P＜0.001)，波形蛋白是转染前2.65倍(t=12.05, P＜0.001)，E-钙黏蛋白是转染前0.64倍(t=4.91, P＜0.001)。Transwell结果显示Prrx1过表达的MCF-7细胞发生迁移的细胞数(71.69±6.66)明显高于阴性对照组(40.87±4.16)(t=15.05, P＜0.001)和空白对照组(41.2±4.62)(15.76, P＜0.001)，差异有统计学意义，而两对照组之间比较差异无统计学意义(t=0.21, p=0.84)。CCK-8结果显示Docetaxel作用MCF-7细胞24h和48h后的 IC50值分别是(10.94±0.64)、(10.66±1.68)，差异无统计学意义(t=0.27, p=0.80)。慢病毒感染后，Prrx1过表达的 MCF-7细胞的 IC50明显高于空白对照组(13.30, P＜0.001)和阴性对照组(t=0.91, P＜0.001)，且差异有统计学意义，而两对照组之间比较差异无统计学意义(t=0.22, p=0.83)。流式细胞术结果显示Docetaxel处理三组细胞24h后 Prrx1过表达的 MCF-7细胞的凋亡率明显低于阴性对照组(t=9.32, P＜0.001)和空白对照组(t=9.70, P＜0.001)，差异有统计学意义，而两对照组之间比较差异无统计学意义(t=0.48, p=0.65)。Western blot结果显示：Prrx1过表达MCF-7细胞的Twist1和多药耐药相关蛋白1(MDR1,ABCB1,P-gp)相对表达量明显高于两对照组，且差异有统计学意义(P＜0.001)，而两对照组之间比较差异无统计学意义(P＜0.05)。
　　【结论】：Prrx1诱导EMT促进乳腺癌细胞对Docetaxel耐药。

目录

引言

材料与方法

1主要试剂及来源

2主要仪器及来源

3主要溶液的配制

4细胞培养

5 Real-time PCR筛选出Prrx1低表达乳腺癌细胞株

6 慢病毒载体构建和转染情况

7 Transwell法检测Prrx1过表达对MCF-7细胞迁移能力的影响

8 Western blot检测Twist1及ABCB1的表达

9 CCK-8检测细胞IC50

10 流式细胞仪检测Docetaxel对三组细胞凋亡率的影响

11统计学方法

结果

2荧光显微镜观察慢病毒感染MCF-7细胞后绿色荧光蛋白的表达

3 实验组、空白对照组和阴性对照组中 Prrx1、波形蛋白和 E-钙黏蛋白mRNA表达

4 Prrx1过表达对MCF-7细胞迁移能力的影响

5 CCK-8检测MCF-7细胞24h、48h以及转染前后不同三组的IC50

6 流式细胞术检测Prrx1过表达对MCF-7细胞凋亡率的影响

7 Western blot 检测病毒感染后的乳腺癌 MCF-7 细胞 Prrx1、Twist1、ABCB1的表达

讨论

结论

参考文献

综述:EMT与耐药的相关性研究

攻读学位期间的研究成果

致谢

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