EB病毒相关胃癌中RASSF1A基因甲基化状态和表达的研究

摘要

EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)是疱疹病毒属γ疱疹病毒亚科成员，是重要的DNA肿瘤病毒。EBV感染与部分胃癌的关系已经得到确认，但EBV相关胃癌(EBV-associated gastric carcinoma, EBVaGC)的发病机制尚未完全明了。近来研究表明EBV可能通过诱导某些抑癌基因启动子区CpG岛高甲基化而使该基因功能失活参与胃癌的发生发展。
　　目的：明确EBV阳性和阴性胃癌细胞系以及EBVaGC和EBV阴性胃癌(EBV-negatived gastric carcinoma, EBVnGC)组织中RASSF1A基因启动子区甲基化状态以及对其表达的影响，为进一步明确Ras相关结构域家族基因1A(ras associated domain family gene1A, RASSF1A)基因在EBVaGC发生中的作用及作用机制提供实验基础。
　　方法：采用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR, MSP)和基于焦亚硫酸氢盐修饰的基因组测序法(Bisulfite genomic sequencing, BGS)检测5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine,5-Aza-dc)处理前后8种胃癌细胞系以及胃癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化状态；实时荧光定量PCR(Real time quantitative PCR, real time qPCR)检测EBV阴性及阳性细胞系中RASSF1AmRNA的转录表达；免疫组化技术检测EBVaGC和EBVnGC组织中RASSF1A蛋白表达。
　　结果：①MSP检测结果显示4种EBV阳性胃癌细胞系(GT38, GT39, SNU719, AGS-EBV) RASSF1A基因启动子区呈未甲基化状态，电泳结果为U型，4种EBV阴性胃癌细胞系(HGC-27, MKN-45, SGC7901, AGS) RASSF1A基因启动子区呈高甲基化状态，电泳结果为M型。BGS检测RASSF1A基因启动子区的86个CpG位点甲基化状态，结果显示：4种EBV阳性胃癌细胞系除少量位点发生甲基化外，其余位点均未发生甲基化，甲基化率均小于10%；而4种EBV阴性胃癌细胞系则表现为几乎所有位点的甲基化，甲基化率均达90%以上。②MSP检测结果显示：36例EBVaGC组织中有28例为M型(28/36,77.8%)，M+U型为8例(8/36,22.2%)；41例EBVnGC组织中U型有33例(33/41,80.5%)，M+U型为8例(8/41,19.5%)。BGS结果显示：36例EBVaGC平均甲基化率达86%以上；41例EBVnGC平均甲基化率为22.3%。③经去甲基化试剂5-Aza-dc处理后，4种EBV阴性细胞系MSP电泳结果均发生变化，由原来的M型转变成M＋U型；而4种EBV阳性细胞系MSP电泳结果仍为U型。④EBV阳性胃癌细胞系RASSF1A基因的转录表达水平均高于阴性胃癌细胞系。5-Aza-dc作用后，EBV阴性胃癌细胞RASSF1A基因的转录表达水平明显升高，EBV阳性胃癌细胞系则无明显变化。⑤EBVaGC和EBVnGC组织中RASSF1A蛋白表达在EBVaGC和EBVnGC组织中无显著差异(P＞0.05)。
　　结论：①EBV阳性和EBV阴性胃癌细胞系中RASSF1A基因启动子区甲基化状态不同，提示EBV感染可导致RASSF1A基因启动子区甲基化状态发生改变。②RASSF1A基因启动子区的高甲基化可抑制该基因的转录表达；去甲基化试剂5-Aza-dc处理可使RASSF1A基因启动子区去甲基化，使得该基因表达水平升高。③EBVaGC和EBVnGC中组织中RASSF1A基因启动子区甲基化状态不同，提示EBV感染可能是导致RASSF1A基因启动子区域甲基化的原因；但其与EBV阳性细胞系RASSF1A基因启动子区低甲基化现象相左的结果需要我们进一步深入研究加以证实。

目录

引言

材料与方法

1 仪器、试剂和耗材

2细胞系及胃癌组织标本的选择

3 细胞的处理

4 胃癌组织的处理

5 DNA样本的焦亚硫酸盐修饰

6 RASSF1A甲基化状态检测

7 RASSF1A mRNA检测

8 免疫组织化检测胃癌组织RASSF1A蛋白表达

9统计学分析

结果

1 RASSF1A启动子甲基化状态检测结果

2 Real-time PCR检测药物作用前后细胞系基因的转录表达

3 RASSF1A蛋白在胃癌组织中的表达

讨论

结论

参考文献

综述:RASSF1A基因甲基化状态与肿瘤的研究

攻读学位期间的学术成果

致谢

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