锦葵在大鼠心脏缺血/再灌注中的心肌保护作用

摘要

研究目的： 以心肌梗死为代表的缺血性疾病发病率逐渐增高。缺血心肌组织损伤主要由组织血液供应中断的幅度和持续时间决定。及时再灌注治疗使缺血器官、组织重新获得血液供应，可以减轻缺血组织的损伤和坏死。但近来的研究发现心肌组织虽然血流恢复，但也会引起血管内皮细胞功能异常、激活相关炎症因子等,反而会加重缺血心肌的损伤,导致再灌注损伤。这种再灌注损伤减弱了再灌注治疗所得到的益处。因此,减少再灌注损伤成为心肌梗死防治的非常重要环节之一。超氧化物歧化酶（ Superoxide dismutase,SOD）和谷胱甘肽氧化酶作为活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除剂，起到间接心脏保护作用。研究表明一氧化氮（nitric oxide，NO)产生平衡线粒体Ca2+的体内平衡，从而保护组织免受心肌缺血的损伤。白细胞介素（Interleukin,IL）-10具有抗炎和抗动脉粥样化功能，在心肌缺血中起保护作用。此外，心肌缺血/再灌注时IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α, TNF-α）等几种细胞因子的表达增强，在缺血/再灌注损伤中起重要作用。 锦葵（Malva sylvestris L，MS）属于锦葵科，具有抗炎、抗氧化、抑菌、镇痛和抗胆碱酯酶活性的广泛药理作用。其含有几种药理活性化合物，如精油，倍半萜，香豆素和花青素。实验发现香豆素类化合物和花青素具有潜在减轻心肌缺血时组织损伤作用。锦葵对心脏缺血/再灌注损伤是否具有保护作用，以及是否对ROS、炎症因子有影响未见相关报道。 本研究将探讨MS预处理是否能减轻大鼠心脏缺血/再灌注损伤，对在体缺血/再灌注心肌起到保护作用，并探讨其潜在分子机制。 研究方法： 1、MS提取物的制备：整个植物在洗涤后风干。将干燥的植物切成小块，并用研磨机研磨成粗粉。将该粉末与95％甲醇混合7天，在室温下浸渍。将萃取液过滤，滤液在旋转蒸发器中干燥。 2、心脏缺血/再灌注模型复制：雄性SD大鼠适应性饲养1周，随机分为4组：对照组(n=10)，双蒸水2ml/d灌胃15天；缺血/再灌注组（MI/R）(n=10)，双蒸水2ml/d灌胃15天；药物干预250mg/kg组（MS250mg/kg）(n=10)，以MS250mg/（kg·d）溶于双蒸水灌胃15天；药物干预500mg/kg组（MS500mg）(n=10)，MS500mg/（kg·d）用双蒸水配成悬液灌胃15天。15天干预结束时，除假手术组的大鼠外，其他三组大鼠结扎左冠状动脉前降支30min，随后开放120min；而假手术组中的大鼠仅开胸，未结扎冠脉左前降支，其他步骤相同。再灌注120min时取各组大鼠的血液及心肌组织待检。 3、心电图检测：采用计算机化的电源实验室系统，在标准导联II获取M I/R大鼠心电图，测量ST段抬高程度。 4、血清学指标：比色法检测各组大鼠血清中天冬氨酸转氨酶（AST）、肌酸激酶同工酶-MB（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH）的浓度；ELISA检测C-反应蛋白、巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）、NO。 5、心肌组织指标：使用特定的组织匀浆ELISA试剂盒检测炎性细胞因子：TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6；使用核黄素敏化方法检测大鼠的心肌组织中的SOD活性；脂质过氧化物(lipid peroxidation, LPO)产物主要为丙二醛(Malonaldehyde, MDA)，通过检测MDA的含量及水平可以间接检测LPO严重程度；在心肌组织中以氧化H2O2的能力评估过氧化氢酶（Catalase，CAT）的活性;应用Westen blot检测心肌组织中的一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthetase,NOS）的表达。 研究结果： （1）MS对心电图ST段的影响：在缺血/再灌注大鼠结扎前、缺血后30min，再灌注120min后进行评估MS对ST段抬高的影响，发现心肌缺血组ST段明显升高，与对照组比较有显著性差异(P＜0.01）。与MI/R组相比较，MS治疗后显著降低ST段抬高的程度(P＜0.01）。 （2）MS对大鼠血清AST、LDH和CK-MB浓度的影响：与对照组相比，MI/R组血清中AST、LDH、CK-MB的浓度明显升高。与MI/R组相比，MS处理组血清中AST、LDH和CK-MB浓度明显降低（P＜0.01）。 （3）MS对C反应蛋白和MIP-1α水平的影响：与对照组比较，MI/R组血清C反应蛋白和MIP-1α浓度均显着升高（P＜0.01）。MS治疗组的血清C反应蛋白和MIP-1α浓度同MI/R组的血清C反应蛋白（P＜0.05）和MIP-1α（P＜0.01）相比较均降低。 （4）MS对血清NO浓度的影响：与对照组相比，M I/R组血清NO浓度明显降低。然而，MS处理组与MI/R组相比，MS处理后显著提高了血清NO浓度（P＜0.01），且同MS剂量呈正相关。 （5）MS对SOD、LPO和CAT的影响：MI/R组心肌组织中LPO水平较对照组显著升高；MS组同MI/R组相比较，心肌组织LPO水平显著降低；而MS组与MI/R组比较，SOD活性和CAT活性均明显升高，均具有统计学意义（均P＜0.01）。 （6）MS对细胞因子的影响：同对照组相比，MI/R组心肌组织IL-1β、IL-6和TNF-α浓度明显升高（P＜0.01），IL-10浓度明显降低（P＜0.01）。然而，与MI/R组相比， MS干预可以抑制因MI/R引起的IL-1β、IL-6和TNF-α升高程度，同时提高IL-10的水平（P＜0.01），并且MS500mg/Kg组同MS250mg/Kg组相比较，IL-10升高更显著（P＜0.05）。 (7) MS对心肌组织NOS的影响：MI/R组心肌组织NOS表达明显减少，同contral组相比，具有显著差异（P<0.01）；MS干预可以减轻MI/R对心肌内NOS表达的抑制，但仍较control组大鼠低，具有显著差异（P<0.01）;不同剂量MS干预，也具有差异性， MS500mg/Kg组较MS250mg/Kg组表达增加，具有统计学意义（P<0.05）。 研究结论： （1）MS抑制LPO、升高SOD和CAT水平，对大鼠M I/R引起的氧化应激有抑制作用； （2）MS对MI/R引起的NOS和NO降低有升高作用； （3）MS能抑制大鼠M I/R引起IL-1β、IL-6和TNF-α表达升高，并提高IL-10的表达； （4）MS预处理可以减少大鼠心脏缺血/再灌心肌损伤，对缺血/再灌注心脏具有保护作用。 研究意义： 本实验首次证实了MS能减轻大鼠心脏缺血/再灌注心肌损伤，对指导以器官特异性血液减少为特征的疾病的治疗具有重要的临床现实意义。本实验还进一步探讨了MS降低心肌缺血/再灌注损伤中可能参与的机制，为应用MS临床应用减轻心肌缺血/再灌注损伤临床治疗提供了分子机制理论基础。

目录

引言

技术路线图

第一部分 MS对大鼠在体心脏MI/R的保护作用及其氧化应激的影响

材料

实验方法

结果

讨论

第二部分 MS对MI/R细胞因子及NO的影响

材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间的研究成果

缩略词表

致谢

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