CXXC5表达通过Wnt/β-catenin通路对博莱霉素小鼠肺纤维化的影响

摘要

目的：明确在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠中，CXXC5的表达及Wnt/β-catenin通路的活化情况。探讨通过外源性调控使CXXC5过表达，对博莱霉素小鼠肺纤维化及Wnt/β-catenin通路的影响。初步探讨CXXC5参与肺间质纤维化可能的机制，为肺间质纤维化探寻新的干预靶点。 方法：构建有示踪基因绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）标记的过表达CXXC5腺病毒载体（Ad-CXXC5）。实验分组：生理盐水组（Mock组）、纤维化组（BLM组）、生理盐水+Ad-GFP感染组（Mock+Ad-GFP组）、生理盐水+Ad-CXXC5感染组（Mock+Ad-CXXC5组）、纤维化+Ad-GFP感染组（BLM+Ad-GFP组）、纤维化+Ad-CXXC5感染组（BLM+Ad-CXXC5组）。本实验的实验组和对照组分别采用气管内滴入生理盐水及博莱霉素，并在造模次日，小鼠尾静脉注射相应的腺病毒进行造模，在第7天、14天、28天分别处理一批实验小鼠，收集小鼠肺组织标本、BALF液用于下列检测。通过HE染色、Masson染色、肺组织羟脯氨酸测定、Ashcroft评分评估不同时间段各组小鼠肺组织的纤维化程度。各组小鼠BALF液的细胞分类、计数。Western Blot检测各组小鼠肺组织中CXXC5、β-catenin、Dvl、α-SMA、E-cadherin、Vimentin、CollaⅠ、CollaⅢ的表达。RT-qPCR测各组小鼠肺组织中CXXC5mRNA、α-SMA mRNA、proCollaⅠmRNA、proCollaⅢmRNA的表达。ELISA测各时间点肺组织中CollaⅠ、CollaⅢ的表达。 结果：成功构建CXXC5过表达的腺病毒载体Ad-CXXC5，并通过博莱霉素诱导，构建出肺纤维化的小鼠模型。通过小鼠肺组织HE、Masson染色、羟脯氨酸含量测定及Ashcroft评分发现，BLM组小鼠肺组织纤维化程度较Mock组严重，提示肺纤维化小鼠模型构建成功；BLM组与BLM+Ad-GFP组小鼠肺组织纤维化程度无明显差异，提示腺病毒载体本身对小鼠肺组织纤维化程度无影响；BLM+Ad-CXXC5组与BLM组、BLM+Ad-GFP组相比，纤维化程度明显降低。对三个时间点各组小鼠BALF液进行细胞分类和计数发现，Mock组与Mock+Ad-GFP组、Mock+Ad-CXXC5组的细胞总数、巨噬细胞百分比、中性粒细胞百分比在三个时间点均无明显差异；而BLM组的细胞总数、中性粒细胞百分比明显高于Mock组，巨噬细胞百分比低于Mock组；BLM+Ad-CXXC5组中细胞总数及中性粒细胞百分比均低于BLM组和BLM+Ad-GFP组，而巨噬细胞百分比较后两组显著升高。Western Blot测各时间点、各组肺组织中CXXC5、β-catenin、Dvl、α-SMA、E-cadherin、Vimentin、CollaⅠ、CollaⅢ蛋白的表达。发现与Mock组相比，BLM组CXXC5的表达明显降低，而Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin及Dvl明显升高，间充质细胞及胶原标志物Vimentin、α-SMA、CollaⅠ、CollaⅢ等蛋白的表达上调，但上皮细胞的标志物E-cadherin的表达下调。BLM+Ad-CXXC5组与BLM+Ad-GFP组相比，CXXC5及E-cadherin的表达明显升高，而β-catenin、Dvl、α-SMA、Vimentin、CollaⅠ、CollaⅢ的表达均下降，表明在CXXC5过表达后，Wnt/β-catenin通路活性下降、纤维化程度降低。RT-qPCR测CXXC5mRNA、α-SMA mRNA、proCollaⅠmRNA的表达发现，BLM组较Mock组CXXC5mRNA的相对量明显降低，而α-SMA mRNA、proCollaⅠmRNA、proCollaⅢmRNA的相对量升高。BLM+Ad-CXXC5组中CXXC5mRNA的相对量高于BLM+Ad-GFP组，而α-SMA mRNA及proCollaⅠmRNA、proCollaⅢmRNA的相对量均低于BLM+Ad-GFP组。ELISA测各组肺组织中CollaⅠ、CollaⅢ的表达发现，BLM组肺组织中的CollaⅠ、CollaⅢ含量均高于Mock组，且随着时间推移，逐渐升高；分别比较Mock组和Mock+Ad-GFP组、BLM组和BLM+Ad-GFP组CollaⅠ、CollaⅢ含量，发现差异无统计学意义；而BLM+Ad-CXXC5组中的含量明显低于BLM组及BLM+Ad-GFP组。 结论：1.在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中，CXXC5的表达下调。2.在博莱霉素肺纤维化小鼠的肺组织中Wnt/β-catenin通路活化。3.CXXC5过表达能抑制Wnt/β-catenin通路关键蛋白、EMT及成纤维细胞转分化过程相关蛋白表达，减轻小鼠肺组织纤维化程度。4.CXXC5可能通过负反馈调节Wnt/β-catenin通路，抑制EMT及成纤维细胞转分化，参与肺纤维化的发病、进展。

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