热胁迫对南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L影响的研究

摘要

南极冰藻是生长在南极海冰、海冰边缘等极端环境中各类微藻的总称，极地环境的严酷造就了其特殊的生物学特征。近年来随着全球气候变暖，海冰融化的趋势加剧，南极冰藻抵抗高温胁迫的机制和能力是决定其种类生存的重要因素之一。所以研究温度升高后南极冰藻的响应机制具有重要的理论意义和应用价值。本文以南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L为对象进行研究，成果如下： （1）基于转录组测序结果分析，筛选到了南极冰藻ICE-L的8个热激蛋白Hsp70基因、3个Hsp90基因、1个Hsp22基因以及2个热休克因子Hsf基因。对这些基因进行qRT-PCR分析结果显示，在15℃热胁迫下，8个CiHsp70s基因中，CiHsp70B基因对高温胁迫最为敏感，能够快速响应温度的变化，3h内表达量便达到对照组的12.18倍。CiHsp70E1、CiHsp70E2和CiDnaK基因响应高温较慢，但是表达水平也很高，表达量呈现先升高后降低的趋势，最大相对表达量分别为对照组9.76、5.42和6.22倍。CiHsp70C和CiHsp70D基因表达量较低分别为3.18和3.87倍。CiHsp70A和CiHsp70G基因受热胁迫影响的表达变化不明显。在15℃热胁迫下，CiHsp90A、CiHsp90B和CiHsp90C基因相对表达量均呈先升高后降低的趋势，48h达到最大值分别为对照组的2.92、4.40和20.37倍，CiHsp90C基因响应高温胁迫最明显，而且表达水平非常高。CiHsp22基因对高温的响应非常迅速且表达水平显著上调，在3h和6h基因表达量都维持在较高的水平分别为对照组15.93倍和15.05倍。2个热休克因子中，CiHsf2基因没有明显地表达，而CiHsf1基因能够迅速响应高温，之后也持续稳定在较高水平，120h达到最大值为对照组的10.88倍。 （2）利用NCBI、ExPASy、WoLF PSORT和MEGA6.06等各种公共数据库及分析软件对南极冰藻ICE-L的CiHsp70s进行了生物信息学分析。结果表明，CiHsp70s开放阅读框编码642~985个氨基酸。功能域预测表明均属于Hsp70超家族。亚细胞定位预测显示，CiHsp70A、CiHsp70E和CiDnaK定位于细胞质，CiHsp70B和CiHsp70D定位于叶绿体，CiHsp70C定位于线粒体，CiHsp70G定位于内质网。系统发育分析结果显示，除CiDnaK外，南极冰藻ICE-L其他的CiHsp70s都可以在绿藻中找到同源蛋白，且均与莱茵衣藻（C.reinhardtii）和团藻（V.carteri f.nagariensis）的同源性较高。CiDnaK与原核生物同源性较高，尤其与嗜冷菌（Psychroflexus torquis）有100%的序列同源性。为进一步研究CiDnaK的功能，将CiDnaK基因成功转入莱茵衣藻（C.reinhardtii137c）中。检测其耐热性能发现，CiDnaK在一定程度上提高了莱茵衣藻的耐高温（42℃）能力，但随着处理时间的延长，其保护作用也随之减弱。 （3）测定南极冰藻ICE-L在热胁迫下的抗氧化酶活性变化结果显示，POD活性变化最为明显，虽然前期响应温度的变化较缓慢，但从72h开始POD酶活急剧增加，到144h比基础水平提高了约70倍，编码PTS1receptor的基因CiPEX5在15℃胁迫下表达显著上调，72h可达到对照组的18.11倍；CAT在24h内能快速响应温度的变化，到72h升高到基础水平的2倍左右后活性降低，其中一个编码基因CiCAT（45467）在热胁迫下相对表达量先升高，到72h为对照组4.67倍，而后下降；SOD的活性在热胁迫120h之内基本保持低于对照组的水平，其中4个编码SOD的基因在转录水平的表达也均受到了不同程度的抑制。另外，MDA含量24h内迅速提高，说明在热胁迫初期机体膜系统受到了损伤。随着处理时间的延长，MDA含量降低，到144h MDA基本恢复到了细胞耐受水平。 本研究以南极冰藻ICE-L为研究对象，首次对其在热胁迫下热激蛋白和抗氧化系统的响应进行了初步的研究，为进一步探索南极冰藻对高温的响应机制提供了基础。

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学术硕士学位论文

第一章 引言

1.1 南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L概述

1.1.1南极冰藻的生存环境

1.1.2 南极冰藻的生态学和应用意义

1.1.3 南极冰藻ICE-L的生物学特征

1.1.4 南极冰藻ICE-L的研究现状

1.2 植物耐热分子机制研究

1.3 热激蛋白简介

1.3.1 热激蛋白的发展

1.3.2 热激蛋白的分类及其生物学功能

1.3.3 Hsf

1.3.4 Hsp70

1.3.5 Hsp90

1.3.6 藻类热激蛋白的研究

1.4 植物活性氧的产生、清除以及植物抗氧化系统

1.4.1 活性氧的产生及影响

1.4.2 抗氧化系统的防御机制

1.4.3 藻类抗氧化系统的研究

1.5 本论文的研究目的及意义

第二章 热胁迫下南极冰藻ICE-L热激蛋白基因的表达分析

2.1 实验材料

2.1.1 实验藻种

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.2.1 引物设计

2.2.2 藻种热胁迫处理

2.2.3 总RNA提取及反转录

2.2.4 实时荧光定量PCR

2.2.5 数据处理

2.3 结果与分析

2.3.1 总RNA质量检测

2.3.2 热胁迫下CiHsp70s表达量变化

2.3.3 热胁迫下CiHsp90s表达量变化

2.3.4 热胁迫下CiHsp22表达量变化

2.3.5 热胁迫下CiHsfs表达量变化

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 南极冰藻ICE-L CiHsp70s序列分析及CiDnaK基因的克隆与真核表达

3.1实验材料

3.1.1 实验藻种

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.2 实验方法

3.2.1 生物信息学分析

3.2.2 CiDnaK 基因的克隆

3.2.3 pChlamy_3-CiDnaK的构建

3.2.4 转化莱茵衣藻

3.2.5 转CiDnaK莱茵衣藻抗高温能力检测

3.3 结果与分析

3.3.1 CiHsp70s生物信息学分析

3.3.2 CiDnaK 基因的克隆以及pChlamy_3-CiDnaK的构建

3.3.3 阳性克隆筛选

3.3.4 转CiDnaK莱茵衣藻抗高温能力检测

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 热胁迫下南极冰藻ICE-L抗氧化酶基因的表达及酶的活性变化分析

4.1 实验材料

4.1.1 实验藻种

4.1.2 主要试剂

4.1.3主要仪器

4.2.1 引物设计

4.2.2 藻种热胁迫处理

4.2.3 总RNA提取及反转录

4.2.4 实时荧光定量PCR

4.2.5 粗酶液的提取

4.2.6 SOD、CAT、POD及MDA测定原理及活力计算

4.3 结果与分析

4.3.1 热胁迫下部分抗氧化酶基因的表达分析

4.3.2 热胁迫下南极冰藻ICE-L超氧化物歧化酶（SOD）活性变化

4.3.3 热胁迫下南极冰藻ICE-L过氧化氢酶（CAT）活性变化

4.3.4 热胁迫下南极冰藻ICE-L过氧化物酶（POD）活性变化

4.3.5 热胁迫下南极冰藻ICE-L丙二醛（MDA）含量变化

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢