Piezo1 siRNA基因转染对应力模型中OA患者软骨细胞的影响

摘要

目的：研究Piezo1基因敲除对体外机械牵张应力模型中人OA软骨细胞分泌细胞外基质的影响，探索机械敏感性离子通道Piezo1与p38MAPK信号通路在机械应力介导的软骨基质降解中的交互作用，寻找OA基因治疗新思路。 方法：参考GeneBank human FAM-38A mRNA（XM_361182）序列，设计针对Piezo1的特异性小干扰RNA。取OA患者的全膝关节置换术术后标本，剪碎、消化、培养获得纯净软骨细胞，应用Flexcell体外细胞加力仪构建牵张应力模型，实验研究分组：0h牵张应力组（空白对照组），2h牵张应力组，12h牵张应力组，24h牵张应力组，48h牵张应力组以及转染组（分别转染载有目的基因序列的Piezo1-siRNA，载有杂乱序列的阴性对照，空白对照组以培养基代替病毒液），抑制剂组（加入p38的特异性抑制剂SB203580）。应用免疫荧光染色，激光共聚焦技术定位Piezol和p38在OA软骨细胞中的表达位置及Piezo1在机械牵张应力下的表达变化；应用Real-time PCR技术检测机械牵张应力模型下各组软骨细胞Piezo1、p38、MMP-13、TIMP1、Collagen II和Aggrecan mRNA的表达情况；应用Western blot技术检测细胞外基质中Collagen II和Aggrecan蛋白的表达情况。 结果：（1）Piezo1蛋白主要表达在OA软骨细胞的细胞核中，部分表达在细胞质和细胞膜；p38主要表达在OA软骨细胞的细胞质。 （2）RT-PCR检测结果：12h应力组与2h应力组相比Piezo1mRNA表达量明显增加（P＜0.05），24h机械牵张应力组Piezo1mRNA表达量最高，48h应力组与24h应力组比较，Piezo1mRNA相对表达量显著下降（P＜0.05），p38和MMP-13mRNA与Piezo1mRNA有相同的表达趋势；siRNA转染组、SB203580抑制剂组的p38、MMP-13mRNA表达量与机械牵张应力组相比均下降（P＜0.05），SB203580抑制剂组Piezo1mRNA表达量与机械牵张应力组相比无显著性差异（P＞0.05）。 （3）随异常机械应力时间延长，与空白对照组相比Collagen II和Aggrecan在蛋白水平的表达量呈降低趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论：（1）慢病毒介导的Piezo1基因沉默后，可以有效抑制机械牵张应力模型中软骨细胞Piezo1的表达，并且对软骨细胞的生长状态无明显影响。 (2)机械敏感性离子通道Piezol与p38MAPK在应力介导的软骨基质降解中存在交互作用，Piezo1可经p38MAPK信号通路诱导MMP-13的表达，加速软骨基质的降解和软骨破坏。 (3)沉默Piezo1基因可以有效抑制经p38MAPK信号通路诱导的MMP-13的表达，上调TIMP1的表达，进而发挥对OA软骨细胞的保护作用。

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