miRNA-17-5p对湿性AMD患者抗VEGF治疗的作用及机制研究

摘要

目的： 观察湿性年龄相关性黄斑变性（AMD）患者抗新生血管内皮生长因子（VEGF）药物治疗后房水中微小RNA（miRNA）水平改变，并探讨其与预后的相关性及可能的作用机制。 方法： 1、选取20例（20眼）湿性AMD患者，签署知情同意书。分别在第一次、第二次行玻璃体腔注射抗VEGF药物时抽取约50ul房水，通过miRNA衍生片段长度多肽性（miRFLP）直接测定法检测房水中16种可能相关的miRNA水平，分析抗VEGF治疗前后miRNA水平变化，筛选出有规律变化的miRNA种类，然后比较其与中心视网膜厚度（CMT）变化的相关性。 2、采用HUVEC细胞，将与CMT有相关性的miRNA过表达，检测细胞表达的目的基因及蛋白的水平，探讨可能的作用机制。通过TargetScan算法分析该miRNA的潜在靶点，将预测出的靶基因与血管生成强相关的TGF-β家族进行交叉对比，选出实验的目的基因及蛋白。实验分为药物对照组、miRNA mimic组、mimic阴性对照组。通过qRT-PCR检测细胞转染效率以确定实验转染浓度。通过CCK8检测细胞活性以确定实验转染时间。采用上述转染浓度及转染时间进行实验。通过qRT-PCR及Western Blot检测各组目的基因及蛋白的表达水平。 结果： 1、筛选出抗VEGF治疗前后房水miRNA变化有统计学意义的miR-17-5p（t=-4.134，P=0.001）及miR-146a（t=-4.566，P=0.000）；治疗前后房水中miRNA表达量改变与CMT改变的Spearman相关性分析结果显示：miR-17-5p（r=－0.528，P=0.017），miR-146a（r=0.226，P=0.339）。 2、选出的靶基因为TGF-β2和GDF11。qRT-PCR结果显示：miRNA（miR-17-5p）最佳转染浓度为50nM。CCK8结果显示：miRNA（miR-17-5p）最佳转染时间为24h。qRT-PCR结果显示：与药物对照组相比，miRNA（miR-17-5p）mimic组的TGF-β2表达水平明显下降(t=26.669,P=0.001），mimic阴性对照组的表达水平无明显变化(t=0.956,P=0.440）；与药物对照组相比，miRNA（miR-17-5p）mimic组的GDF11表达水平明显上升(t=-3.357,P=0.028），mimic阴性对照组的表达水平无明显变化(t=-1.420,P=0.292）。Western Blot结果显示：与药物对照组相比，miRNA（miR-17-5p）mimic组的TGF-β2表达量明显下降(t=13.046,P=0.000），mimic阴性对照组的表达量无明显变化(t=-0.559,P=0.632）；与药物对照组相比，miRNA（miR-17-5p）mimic组的GDF11表达量明显上升(t=-21.714,P=0.002），mimic阴性对照组的表达量无明显变化(t=0.674,P=0.537）。 结论： 1、抗VEGF药物治疗后，患者房水中miRNA-17-5p表达量与黄斑结构改善正相关。 2、上调miRNA-17-5p可能通过抑制TGF-β2、促进GDF11的表达，进而参与到抗VEGF治疗的“应答”过程。

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引言

1 实验材料

1.1 临床标本的来源

1.2实验试剂

1.3实验耗材

1.4实验仪器

2实验方法

2.1临床OCT检查

2.2 临床标本的采集

2.3临床标本的检测（miRFLP直接测定法）

2.4统计学分析

3 试验结果

3.1患者CMT情况

3.2 房水各miRNA表达情况

3.3相关性分析

4小结

第二部分 miR-17-5p上调对TGF-β2及GDF11表达的影响

1 试验材料

1.1 实验细胞系

1.2实验试剂

1.3实验耗材

1.4实验仪器

1.5主要溶液的配制

2.1.1细胞复苏

2.1.2细胞传代

2.1.3细胞冻存

2.1.4细胞计数

2.2 选择实验的目的基因及蛋白

2.3实验分组

2.4转染

2.5.1 miRNA引物

2.5.2总RNA提取

2.5.3miRNA逆转录

2.5.4qRT-PCT检测

2.6细胞活性检测（CCK8法）

2.7.1 PCR引物

2.7.2总RNA提取

2.7.3反转录反应

2.7.4 qRT-PCR检测