安普霉素生物合成相关基因aprC、aprD的研究

摘要

将黑暗链霉菌H6中与安普霉素抗性基因上游连锁的BglⅡ-BamHI约4.0kb的片段亚克隆、测序,结果表明在这一范围内没有完整的开放阅读框架.原因可能为这一部分已达到了安普霉素生物合成基因簇的末端,不再编码安普霉素生物合成相关基因.抗性基因下游片段和报告基因ermE、xylE插入到质粒pHZ132中,构建用于接合转移质粒.通过接合转移的方法将质粒导入黑暗链霉菌H6中,筛选基因发生重组的菌株,得到编号H6-42-4重组菌株,PCR实验证明质粒DNA已经整合到黑暗链霉菌H6染色体DNA上,传代实验证明基因重组菌株有良好的基因稳定性.H6-42-4号菌株发酵不产生安普霉素,因此克隆得到的aprC、aprD基因和安普霉素生物合成相关.将获得的妥布霉素生产菌株H6-42-4通过NTG诱变和NTG复合妥布霉素耐受诱变筛选妥布霉素高产菌株,效价达到2095u/ml,其中含有氨甲酰妥布霉素91.9﹪.

目录

前言

实验材料

实验方法

1.大肠杆菌质粒DNA小量提取

2.大肠杆菌质粒DNA大量提取

3.链霉菌质粒DNA的提取

4.链霉菌总DNA的提取

5.大肠杆菌DH-5α感受态细胞的制备

6.质粒DNA转化大肠杆菌

7.原生质体的制备、质粒DNA转化

8.DNA酶切和连接

9.DNA电泳和片段回收

10.Klenow酶补平试验

11.接合转移试验

12.PCR反应

13.黑暗链霉菌发酵及检测操作的实验方法

13.1发酵流程：

13.2发酵单位的测定

13.3抗生素组分检测；

14.NTG诱变方法

14.1单孢子悬液的制备：

14.2出发菌株自然分离：

14.3 NTG处理单孢子悬液：

14.4 NTG复合妥布霉素耐受处理：

结果与讨论

第一部分抗性上游基因的克隆及序列分析

第二部分抗性下游基因的克隆及序列分析

2.1抗性下游基因的亚克隆

2.2测序结果

2.3测序结果的Frameplot分析和蛋白同源性比较分析

第三部分克隆基因功能的初步研究

3.1接合转移质粒的构建

3.2接合转移实验

3.3基因重组菌株的获得

3.4基因重组菌株H6-42-4体内游离质粒考察

3.5基因重组菌株稳定性考察

3.6 PCR实验

3.7基因整合分析

3.8安普霉素生物合成过程中aprC、aprD基因作用的推测

第四部分妥布霉素高产菌株菌种选育

4.1出发菌株的确定及其生产能力的考察

4.2二剂量法测定出发菌株实际效价

4.3 NTG及NTG复合妥布霉素耐受处理诱变育种

结论

参考文献

致 谢

附 录

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