绵羊肺炎支原体甘油-3-磷酸氧化酶基因的克隆、表达及重组产物的纯化

摘要

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是引起绵羊传染性胸膜肺炎的主要病原体，其可导致患病绵羊高热、喘气、咳嗽、贫血、生长发育迟缓、渐进性消瘦和肺间质增生等。MO不但能感染绵羊，也能感染山羊。近年来，绵羊传染性胸膜肺炎已成为一种世界性的疾病，给养殖业造成了一定的经济损失，严重影响了养羊业的健康发展。在对肺炎支原体、丝状支原体丝状亚种SC型(M.mycoides subsp.mycoides SC)等研究中均认为甘油是支原体的主要碳源，其代谢产物H2O2是该菌的主要致病因素。而在H2O2的产生过程中，甘油-3-磷酸氧化酶(Glycero(l)3-phosphate oxidase，GLPO)起着重要作用。目前有关MO甘油代谢，以及在该代谢过程中，GLPO所起作用的研究尚属空白。
　　 本研究在MO Y98株(ATCC29419)基因组学测定及分析的基础上，以该菌基因组作为模板，扩增获得了glpO基因全长，对该基因进行了生物信息学分析，并对其密码子进行优化，构建了其原核表达载体，实现了其在大肠杆菌系统中的可溶性表达，最后对其产物进行了初步鉴定及纯化，结果如下：⑴对MO标准株Y98进行扩大培养，提取较高纯度的MO Y98株全基因组，通过电泳检测，获得的基因组纯度较高，可以进行下一步试验。⑵MO Y98株基因组作为模板，以glpO基因序列设计引物，PCR扩增获得glpO全长基因，将该基因插入到pMD(@)18-T T7启动子下游，测序后，对该序列进行了生物信息学分析。⑶根据大肠杆菌密码子偏好性对glpO基因密码子进行碱基优化，亚克隆至pMD(@)18-T载体后，进一步构建了其原核表达载体pET28a-glpOM及相应的重组菌株BL21DE3（pET28a-glpOM），使用IPTG对重组菌株诱导后的产物进行SDS-PAGE及Western blot检测，得到融合蛋白为44 kD。⑷通过Ni柱对获得的目的蛋白粗提液进行纯化，纯化得到了目的蛋白。本实验成功的表达了重组GLPO，并初步对其进行了纯化，为后续的功能研究奠定了基础。

目录

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摘要

中英文缩略词表

第一章 引言

1．1 支原体研究背景

1．2 绵羊肺炎支原体病原学研究

1．3 甘油-3-磷酸氧化酶

1．4 支原体中GLPO的研究进展

1．5 研究目的和意义

第二章 MO Y98株的扩大培养及其基因组的提取

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果与分析

2．4 讨论

第三章 glpO基因的克隆及其生物信息学分析

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 结果与分析

3．3 讨论

第四章 glpO基因的表达及重组产物的初步鉴定与纯化

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 结果与分析

4．4 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简介