宁夏枸杞可培养内生菌的多样性及其生物活性研究

摘要

药用植物内生菌与宿主在长期进化的过程中，能够产生与宿主相同或相似的药用活性代谢产物，已成为人们寻找新型药物的重要来源。本研究以宁夏枸杞为材料，对其各药用组织器官中内生菌的多样性和分布特征进行研究，通过检测菌株的抑菌活性、抗氧化活性和细胞毒活性，旨在筛选出具有药用价值的枸杞内生菌。为探究内生菌活性物质的合成机理及其与宿主植物的协同进化关系、揭示内生菌与道地药材之间的相关性研究奠定基础。主要研究内容与结果如下:
　　(1)采用组织匀浆法从枸杞花、果、叶、根皮中分离出81株内生菌，其中内生细菌39株、内生放线菌11株、内生真菌31株。16SrRNA和rDNA-ITS序列分析结果表明，内生细菌属于7科11属，芽孢杆菌属Bacillus为优势属，分布于所有组织器官中;内生真菌属于1科3属，曲霉菌Aspergillus为优势类群;内生放线菌属于3科4属，多为链霉菌Streptomyces;内生细菌的数量在不同器官中表现为根皮＞叶＞花＞果实;而多样性分布表现为花＞叶＞根皮＞果实。
　　(2)以5种病原菌为指示菌，采用琼脂扩散法，对46株菌的抑菌活性进行测定，结果表明，有29株内生菌对一种或多种病原菌表现出不同的拮抗活性;其中Bacillus菌株EBR2、EBR7、EBL3和短波单胞菌属Brevundimonas的EBR3对番茄炭疽杆菌Colletotrichum nigrum和玉米大斑病菌Exserohilum turcica拮抗活性最强。多数菌株对大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的生长没有明显抑制作用。内生真菌对5种供试病原菌均未表现出拮抗活性。放线菌微杆菌属Microbacterium菌株EAF8对金黄色葡萄球菌的生长有较强的抑制活性。
　　(3)通过Fenton反应法和T-AOC法对菌株的羟自由基清除能力和总抗氧化能力进行测定，结果表明26株枸杞内生菌具有抗氧化能力，但差异较大。其中内生真菌的抗氧化活性相对较强，内生放线菌次之，内生细菌最弱。Aspergillus菌株EFL6、EFL1、EFL9抗氧化活性最强。EFL6总抗氧化能力为(188.5±0.549)U·mL-1，羟自由基清除能力IC50为0.3mg·L-1，菌株EFLI的IC50为0.42mg·L-1，菌株EFL9总抗氧化能力为(113.63±1.021) U·mL-1。
　　(4)以肿瘤细胞A549和Hela为指示细胞系，采用MTT法与CCK-8法，对36株内生菌代谢产物的细胞毒活性进行研究。结果表明有31株内生菌至少对一种肿瘤细胞的生长有抑制作用，17株菌对2种肿瘤细胞的生长都有抑制活性。内生真菌的细胞毒活性强于内生细菌和内生放线菌，曲霉属Aspergillus菌株EFL1对肿瘤细胞的抑制活性最强，对肿瘤细胞A549与Hela细胞的IC50分别为0.22×102mg/L与0.28×102mg/L。
　　宁夏枸杞可培养内生菌遗传多样性丰富，具有较强的抑菌、抗氧化、抗肿瘤活性。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

第一章 文献综述

1．1 植物内生菌概述

1．1．1 内生菌的多样性

1．1．2 植物内生菌分布特征

1．2 植物内生菌的生物学功能

1．2．1 促进宿主植物生长作用

1．2．2 增强宿主植物抗逆作用

1．2．3 植物内生菌的药用活性

1．3 枸杞内生菌研究进展

1．4 本研究目的及意义

1．5 研究内容与技术路线

1．5．1 研究内容

1．5．2 技术路线

第二章 宁夏枸杞可培养内生菌的多样性分析

2．1 材料与方法

2．1．1 供试材料

2．1．2 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 内生菌的分离结果

2．2．2 内生菌的多样性和系统发育分析

2．3 讨论与小结

2．3．1 讨论

2．3．2 小结

第三章 宁夏枸杞内生菌的抑菌活性研究

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．3 讨论与小结

3．3．1 讨论

3．3．2 小结

第四章 宁夏枸杞内生菌的抗氧化活性研究

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 总抗氧化活性

4．2．2 羟自由基清除活性

4．3 讨论与小结

4．3．1 讨论

4．3．2 小结

第五章 宁夏枸杞内生菌的细胞毒活性研究

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．2 结果与分析

5．2．1 初筛结果

5．2．2 梯度活性试验结果

5．3 讨论与小结

5．3．1 讨论

5．3．2 小结

结论

参考文献

附录

致谢

个人简介