绵羊肺炎支原体荚膜多糖对支气管上皮细胞炎性反应与氧化损伤的作用机制研究

摘要

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)是从绵羊或山羊支气管中分离得到的一种最常见的病原菌，主要引起羊支原体肺炎。患病羊临床上以渐进性消瘦、高热、气喘、持续性咳嗽、肺和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症为特征。而与其他支原体相比，目前对于绵羊肺炎支原体致病机制的研究还非常有限，但普遍认为准确的黏附作用应当是决定其是否能够成功感染的关键。绵羊肺炎支原体无细胞壁结构，感染宿主机体时主要通过膜外的荚膜样物质介导菌体与宿主细胞间的相互作用。已有报道证实荚膜多糖（capsular polysaccharides，CPS）是位于绵羊肺炎支原体菌体最外层的一种重要毒力因子，其在菌体抗干燥、粘附、侵入、传播以及抵抗宿主细胞的固有免疫和特异性免疫防御机制等方面的作用正被逐渐认识。
　　本研究在成功提取并纯化了绵羊肺炎支原体模式株Y98荚膜多糖(CPS)的基础上，制备了CPS的多克隆抗体，并利用绵羊支气管原代上皮细胞气液相(air-liquid interface，ALI)培养模型，对CPS诱发免疫学炎性反应与氧化损伤过程中的分子机制进行了探究。研究首先发现，绵羊肺炎支原体CPS刺激ALI支气管原代上皮细胞后诱导了TLRs级联信号通路介导的免疫学炎性反应的发生。TLRs信号中MyD88、IRAKs、TRAF6、p-NF-κB、p-AP-1、IRF5与TRAF3、TBK1、IRF3等关键通路蛋白与核转录因子的表达量在CPS刺激后均呈现出明显的上调趋势，表明TLRs级联的MyD88依赖性与MyD88非依赖性信号转导通路在支气管上皮细胞响应CPS刺激的过程中均扮演重要角色。研究同时发现CPS抗体的预处理可以显著下调由绵羊肺炎支原体感染所诱导的炎性相关因子（包括促炎性细胞因子IL1β、IL6、IL8和TNFα等，抑炎性细胞因子IL10和TGFβ等）的高表达，提示CPS是绵羊肺炎支原体的一个重要毒力因子，其致病机制可能是通过诱导支气管周围大量炎症相关因子的释放，从而实现对宿主免疫学炎症反应的调控。此外，分子机制研究表明绵羊肺炎支原体CPS可以通过线粒体介导的内源性途径与死亡受体介导的外源性途径同时诱导支气管上皮细胞的凋亡，JNK/P38 MAPK信号通路在此过程中起重要的促凋亡作用。值得注意的是，CPS诱发宿主细胞凋亡的过程伴随ROS的高表达，ROS清除剂NAC的预处理可以明显抑制这一现象的发生，因此提示ROS的过量产生可能是诱导绵羊支气管原代上皮细胞凋亡的直接因素之一。
　　以上的研究结果揭示，TLRs信号介导的炎性反应与ROS介导的细胞凋亡在支气管上皮细胞应答绵羊肺炎支原体荚膜多糖刺激的免疫调控机制中发挥了关键性的作用。这些发现为进一步研究绵羊肺炎支原体的主要毒力因子及其致病机理、阐明宿主机体的免疫应答调控机制提供了新的思路。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

第一章 文献综述

1．1．1 绵羊肺炎支原体的生物学特征

1．1．2 支原体致病机制的研究

1．1．3 支原体荚膜(多糖)的研究进展

1．2 Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)信号通路

1．2．1 TLRs的发现

1．2．2 TLRs的组成结构和配体

1．2．3 TLRs信号转导机制

1．3 细胞死亡信号途径

1．3．1 细胞凋亡及相关信号途径

1．3．2 细胞坏死及相关信号途径

1．3．3 肺炎支原体对细胞凋亡的调控作用

1．4 MAPK信号

1．4．1 MAPK信号对细胞炎症的调控作用

1．4．2 MAPK信号对细胞凋亡的调控作用

1．5 研究目的及意义

第二章 绵羊肺炎支原体荚膜多糖的提取、纯化、以及多克隆抗体的制备与鉴定

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．2．3 数据分析

2．3 结果与分析

2．3．1 绵羊肺炎支原体荚膜多糖的提取

2．3．2 绵羊肺炎支原体荚膜多糖的纯化

2．3．3 绵羊肺炎支原体荚膜多糖的纯度鉴定

2．3．4 兔抗绵羊肺炎支原体荚膜多糖血清抗体效价

2．3．5 兔抗绵羊肺炎支原体荚膜多糖血清抗体的特异性

2．4 讨论

第三章 TLR信号在绵羊肺炎支原体荚膜多糖诱导支气管上皮细胞炎性反应中的免疫调节作用

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验设计及技术路线

3．2．3 实验方法

3．2．4 数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 绵羊肺炎支原体荚膜多糖对支气管上皮细胞细胞毒性的时间剂量依赖性

3．3．2 绵羊肺炎支原体荚膜多糖激发支气管上皮细胞的TLR信号

3．3．3 绵羊肺炎支原体荚膜多糖诱导支气管上皮细胞TLR信号介导的炎症反应

3．4 讨论

第四章 绵羊肺炎支原体荚膜多糖诱导支气管上皮细胞ROS介导细胞凋亡的分子机制

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验设计及技术路线

4．2．3 实验方法

4．2．4 数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 绵羊肺炎支原体荚膜多糖激发支气管上皮细胞产生ROS诱导细胞凋亡与坏死的作用机制

4．3．2 内源与外源凋亡机制参与绵羊肺炎支原体荚膜多糖诱导的支气管上皮细胞凋亡

4．3．3 MAPK信号在绵羊肺炎支原体荚膜多糖诱导支气管上皮细胞凋亡中的调控作用

4．4 讨论

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

致谢

作者简介

攻读博士学位期间发表的论文