皂角刺抗肿瘤活性成分与含量测定方法研究

摘要

本研究以皂角刺为研究对象，用MTT法测定抗肿瘤活性，采用体外抗肿瘤活性跟踪与化学分离相结合的方法，确定了皂角刺的抗肿瘤活性成分，并以其为指标对皂角刺药材的质量进行控制。
　　 首先在确定皂角刺乙醇提取物具有抗肿瘤活性的前提下，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到不同萃取层，抗肿瘤活性测定显示：70％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取层对Bel-7402、Hela和KB细胞株的抑制作用较强，IC50值分别为122.7μg·mL-1、118.3μg·mL-1和145.9μg·mL-1。因此确定皂角刺70％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取层为抗肿瘤活性部位。
　　 取皂角刺9kg，用70％乙醇回流提取，乙酸乙酯萃取得到活性部位后，对其进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(100：0～0：100)为洗脱溶剂，以TLC为指导合并相同流分，对得到的七个流分进行抗肿瘤活性试验。结果表明：流分Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ对肿瘤细胞增殖有较好的抑制作用，其对Bel-7402和Hela细胞株的IC50分别为80.2/μg·mL-1、76.5μg·mL-1、76.3μg·mL-1和69.2μg·mL-1、79.9μg·mL-1、88.8μg·mL-1。
　　 进一步采用硅胶柱层析、SephadexLH-20柱层析等多种手段对流分Ⅱ和Ⅳ的化学成分进行了分离、纯化和鉴定。从该活性部位中分离得到了8个化合物，利用理化性质和光谱分析方法将其分别鉴定为：黄颜木素(1)、槲皮素(2)、3β-acetoxyolean-12-en-28-oicacid(3)、木栓酮(4)、棕榈酸(5)、白桦醇(6)、β-谷甾醇(7)和胡萝卜苷(8)。其中化合物2、3、4、5、6和8均为首次从皂角刺中分离。
　　 采用MTT法对以上8个化合物进行抗肿瘤活性分析，结果表明：化合物1和3对多种体外培养的肿瘤细胞具有明显的抗肿瘤活性。其中化合物3对Bel-7402、Hela、HT1080、KB、A549、SGC-7901和Heps等7种肿瘤细胞株生长增殖具有良好的抑制作用，IC50为11.6-18.7μg·mL-1。化合物1对除A549之外的6种肿瘤细胞株抑制作用良好，IC50为11.3-19.3μg·mL-1。由此可以推测化合物1和3为皂角刺抗肿瘤作用的活性成分。
　　 本实验对皂角刺中黄颜木素和槲皮素提取工艺进行研究。采用正交试验设计，以黄颜木素和槲皮素的含量为考察指标，对提取溶剂用量、提取时间和提取次数3个因素进行优化，确定皂角刺中黄颜木素和槲皮素的最佳提取工艺为加15倍量70％乙醇，回流提取2次，每次1h。
　　 首次建立了同时测定皂角刺中黄颜木素和槲皮素的LC-MS分析方法。以Kromasil-C18(250×4.6mmi.d.，5μm)为色谱柱，乙腈-1％冰乙酸水溶液(30：70，v/v)为流动相，流速0.8mL·min-1，柱温35℃，采用ESI源，扫描方式为选择离子监测，检测方式为正离子检测，以黄豆苷元为内标，定量分析m/z287(黄颜木素)，m/z303(槲皮素)，m/z255(黄豆苷元)三个离子，对所收集的17批不同产地的皂角刺药材中黄颜木素和槲皮素进行含量测定。结果表明黄颜木素和槲皮素线性范围分别是：黄颜木素，0.084-2.688μg·mL-1，r=0.9990；槲皮素，0.84-26.88μg·mL-1，r=0.9993。平均回收率(n=9)黄颜木素为97.7％，RSD为1.9％；槲皮素为98.5％，RSD为2.4％。该方法简便快速，重复性好，为今后皂角刺的进一步研究和开发利用奠定了基础。

目录

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第一章 前言

1.1 抗肿瘤中药的研究进展

1.1.1 中药抗肿瘤实验方法

1.1.2 中药抗肿瘤作用机制

1.1.3 中药抗肿瘤活性成分

1.2 MTT法的研究进展

1.3 皂角刺的研究进展

1.3.1 生药学研究

1.3.2 炮制加工

1.3.3 化学成分

1.3.4 药理作用

1.3.5 临床应用

1.3.6 质量控制方法

1.4 立题依据和研究思路

第二章 皂角刺抗肿瘤活性部位筛选

2.1 体外抗肿瘤活性研究方法

2.1.1 MTT法的基本原理

2.1.2 肿瘤细胞的体外培养

2.1.3 抗肿瘤活性测定方法

2.1.4 助溶剂对肿瘤细胞增殖的影响

2.2 皂角刺的提取

2.3 提取物的抗肿瘤活性测定

2.4 皂角刺的萃取

2.5 萃取物的抗肿瘤活性测定

第三章 皂角刺活性部位化学成分分离鉴定与活性测定

3.1 活性部位的初步分离

3.2 不同部位的抗肿瘤活性测定

3.3 活性部位化合物的分离纯化与结构鉴定

3.4 分离化合物的抗肿瘤活性测定

第四章 皂角刺化学成分含量测定方法的研究

4.1 样品的收集与预处理

4.2 皂角刺中黄颜木素和槲皮素提取工艺的考察

4.3 皂角刺中黄颜木素和槲皮素的同时含量测定

第五章 结果与讨论

参考文献

附录

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