黄连-吴茱萸药对主要成分的溶出变化和药动学研究

摘要

不同比例的黄连-吴茱萸药对具有不同的药效，但其物质基础和配伍机理尚未阐明，本研究以化学成分的体外溶出和体内吸收为主线，采用液相色谱和液相色谱-质谱联用技术系统的研究了药对在体外的化学成分及其溶出变化，在体内的动力学过程和代谢产物，为从化学成分的角度阐明配伍机理提供依据。 1.黄连-吴茱萸药对主要成分的研究采用U6(63*3)均匀设计表安排实验，以17个色谱峰和小檗碱含量的综合评分为指标，优化了黄连-吴茱萸药对半仿生提取的最佳工艺条件：三次提取的pH依次是1.6，6.0和7.0，总提取时间为2 h。 以Hypersil BDS C18为色谱柱，乙腈-水(含0.5％甲酸，0.2％氨水)为流动相梯度洗脱，综合分析不同样品的色谱峰保留时间、紫外光谱特征，一级和二级全扫描质谱图，归属了黄连-吴茱萸(6：1)半仿生提取液中的17个色谱峰：8个来自吴茱萸，9个来自黄连，半仿生提取无新的物质生成；指认了4个色谱峰分别为药根碱、羟基吴茱萸碱、巴马汀和小檗碱；推断了另3个色谱峰分别为表小檗碱、非洲防己碱和黄连碱。 建立了全面反映黄连-吴茱萸药对半仿生提取液化学成分的RP-HPLC法，在该条件下对黄连-吴茱萸(1：0，1：1，1：2，1：6，6：1，2：1，0：1)的半仿生提取液进行色谱分析，考察了17个组分与黄连一吴茱萸配伍之间的关系。黄连-吴茱萸不同配伍比例对各主要组分溶出的影响不同。其中，来自吴茱萸药材的8个成分随着配伍黄连比例的增大溶出增加；来自黄连药材的色谱峰7，9，10随着配伍吴茱萸比例的增大溶出增加；来自黄连药材的小檗碱型化合物随着配伍吴茱萸比例的增大溶出减少。 2.黄连-吴茱萸药对中黄连主要成分在大鼠体内的药动学研究建立了大鼠血浆中小檗碱、巴马汀和药根碱同时含量测定的LC-MS/MS方法。血浆样品经沉淀蛋白法预处理后，以乙腈-水(含0.1％甲酸)(70：30，v/v)为流动相，经Hypersil BDS C18柱分离后，采用电喷雾离子源(ESI)，在选择反应监测(SIM)模式下测定待测物的含量。用于定量分析的离子反应分别为m/z 336→320(小檗碱)、m/z352-→336(巴马汀)、m/z338→322(药根碱)和m/z 356→192(内标：四氢巴马丁)。三种待测物均在1-250 ng/mL范围内线性关系良好，定量下限均为1ng/mL。 该法简单、快速、灵敏，并成功应用于大鼠灌胃给予黄连-吴茱萸(6：1)药对(左金丸)后三种成分的药动学研究。小檗碱、巴马汀和药根碱的药-时曲线均呈现多峰现象。采用非房室模型计算各成分的主要药动学参数，其中小檗碱Cmax为121.1±11.9ng/mL，AUC0-∞为28341.5±5241.2 ng·min/mL，t1/2为336.9±46.5 min；巴马汀Cmax为35.2±8.5 ng/mL，AUC0-∞为6345.5±133.9 ng·min/mL，t1/2为215.7±33.5min；药根碱Cmax为218.9±12.8 ng/mL，AUC0-∞为43576.9±4767.8 ng·min/mL；t1/2为325.3±8.0 min，达峰时间均为90 min。 3.黄连-吴茱萸药对中黄连主要成分在大鼠体内代谢产物的初步研究采用LC-MS/MS技术，通过对给药前后大鼠血浆样品的分析，初步推断了大鼠灌胃黄连-吴茱萸(6：1)后黄连主要成分在体内的I相和II相代谢物，结果表明I相代谢物主要来自母药的O-去烷基化反应，药根碱可以形成II相代谢物葡萄糖醛酸结合物，小檗碱和巴马汀则不能与葡萄糖醛酸直接结合，需经I相代谢后才能形成II相代谢物。但由于没有对代谢物结构作进一步确证及缺乏对照品，以上所做的工作只能是一个初步的推测。

目录

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摘要

第一章绪论

1.1黄连—吴茱萸药对的研究概况

1.2中药药动学的研究概况

1.3黄连生物碱的药动学研究概况

1.4立题依据和研究思路

第二章黄连—吴茱萸药对主要成分的溶出变化研究

2.1均匀设计优化黄连—吴茱萸药对的半仿生提取工艺

2.1.1色谱条件

2.1.2方法学确证

2.1.3因素水平设计

2.1.4指标的选择

2.1.5样品测定

2.1.6结果分析

2.1.7提取优化条件的验证

2.2黄连—吴茱萸药对半仿生提取液的HPLC-DAD-MS分析

2.2.1色谱与质谱条件

2.2.2供试液的制备

2.2.3色谱峰的归属

2.2.4色谱峰的定性分析

2.3黄连—吴茱萸药对主要成分的溶出变化

2.3.1色谱条件

2.3.2流动相的选择

2.3.3检测波长的选择

2.3.4溶液的制备

2.3.5巴马汀和小檗碱的含量测定

2.3.6结果分析

2.4小结与讨论

第三章黄连—吴茱萸药对中黄连主要成分在大鼠体内的药动学研究

3.1大鼠血浆中小檗碱、巴马汀和药根碱的同时含量测定

3.1.1 LC-MS/MS条件

3.1.2溶液的制备

3.1.3血浆样品预处理

3.1.4方法学确证

3.2大鼠灌胃黄连—吴茱萸后小檗碱、巴马汀和药根碱的药动学

3.2.1试验动物

3.2.2试验设计

3.2.3数据处理

3.2.4平均血药浓度—时间曲线

3.2.5大鼠血浆中小檗碱、巴马汀和药根碱游离浓度和总浓度的比较

3.3小结与讨论

3.3.1血浆样品预处理方法的建立

3.3.2色谱和质谱条件的优化

3.3.3给药方式和剂量的设计

3.3.4大鼠灌胃黄连—吴茱萸(6：1)后的药动学特点

3.3.5药动学模型的选择

第四章黄连—吴茱萸药对中黄连主要成分在大鼠体内代谢产物的初步研究

4.1 LC-MS/MS条件

4.2 Ⅰ相代谢产物的推断

4.3 Ⅱ相代谢产物的推断

4.4小结与讨论

第五章结论

参考文献

致谢

作者简历